对促销感兴趣? | 点击此处 >>

免疫平行反应监视 (iPRM)

iPRM 是一种多重 LC/MS 实验服务,它结合了质谱法的特异性、免疫检测的通量以及多重分析能加快药物和/或诊断测试上市速度的作用。我们的 iPRM 服务可让你利用 CST 科学家的蛋白质组专业知识,以及 CST 抗体在治疗靶标的流线型测定法开发和可靠验证中的明确特异性和敏感性。iPRM 服务能让你:

  • 从生物标记物发现无缝过渡到生物标记物验证。
  • 分析你的药物对靶标选择造成的影响,以确定在靶/脱靶效应。
  • 对一份复杂生物样品中的几十种分析物进行定量,可信度、敏感性和特异性均很高。

了解更多有关 iPRM 服务的信息,或咨询 CST 的内部专家。

免疫-PRM 检测数据和相应的蛋白印迹实验结果

在白细胞介素-4 (IL-4) 干扰的情况下人肾癌细胞系 ACHN 中磷酸化靶标的免疫-PRM 检测数据和相应的蛋白印迹结果。细胞用 40 ng/ml 人源白细胞介素-4 (hIL-4)#8919 处理 20 分钟后再收集。对于 iPRM 实验,ACHN 细胞蛋白用胰蛋白酶消化,随后将 100 µg ACHN 胰蛋白酶肽与用重同位素标记的肽混合在一起,以作为内部标准品。使用以下每种 CST 抗体 (5 µg) 进行多重免疫沉淀。AKT S473 (#4060), CDK1/2/3 Y15 (#4539), PRAS40 T246 (#2997), STAT3 Y705(#9145), STAT5A/B Y694 (#9314), STAT6 Y641 (#9364), ERK1 T202/Y204(#4370), ERK2 T185(#4370), ERK2 T185 (#4370), Jun S73(#3270). 在免疫富集之后,使用 Q Exactive™ 质谱仪对肽进行多重 PRM 分析。随后从 Skyline 中提取峰面积,并根据肽轻重链比例计算肽浓度。免疫捕获和 PRM 分析重复进行三次。用于 iPRM 实验的抗体也用于蛋白印迹实验。对于每种印迹,往 4%-20% 的 SDS-PAGE 梯度凝胶上上样 20 微克对照和经处理的 ACHN 细胞的蛋白提取物。在转移到硝酸纤维素膜上之后,使用稀释比为 1:1000 的磷酸化特异性抗体检测蛋白。

它是如何工作的

各种临床或临床前研究样品的裂解物(包括细针活检、细胞或组织)均通过蛋白水解消化,并且实验靶标为经抗体富集、以及化学性质与实验靶标相同的定量重同位素标记肽标准品。在 Thermo Scientific™ Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ 质谱仪 (MS) 上分析富集的样品,其中使用靶向 PRM 扫描仪准确地对高特异性靶标和标准肽进行定量。Microsoft® Excel® 和 PowerPoint® 中提供数据。

各种研究的裂解物

免疫富集对 PRM 分析的重要性

比较从 Skyline 提取的峰

在进行 PRM(顶排)和免疫 PRM(底排)分析后,比较从 Skyline 提取的、有关 Jun (S73) 中磷酸肽 LAS*PELER++ 的各种浓度峰。从直接注射 1µg 经胰蛋白酶消化的 SKBR3 裂解物(顶排;PRM)或从对 100 µg SKBR3 肽进行免疫沉淀后再注射(底排;iPRM)的 Skyline 中提取碎片离子波峰 (y7-98+, y6-98+, y5+, y3+, y7-98++, y6-98++),其中质量公差为 0.05 m/z。SKBR3 细胞裂解物中的肽浓度为 0、0.2、2、20、200、2000 amol/µg(从左到右)。肽的检测下限 (LLOD) 从使用 PRM 方法时的 2000 amol/µg 升高到使用 iPRM 工作流程时的 2 amol/µg。

服务选择

从我们下面准备进行的实验列表中选择。这些实验经过了预先验证,并且使用 CST 的组分,包括高亲和力抗体和内部合成的 AQUA 肽标准品。

货号 蛋白 Sitex LLOD (fmol/100 μg) LLOQ (fmol/100 μg)
4060 Akt S473 RPHFPQFS*YSASGTA 0.059 0.117
4539 CDK1/CDK2/CDK3 Y15 IGEGTY*GVVYK 0.015 0.046
2997 PRAS40 T246 LNT*SDFQK 0.004 0.012
9145 STAT3 Y705 YCRPESQEHPEADPGSAAPY*LK 0.124 0.373
9314 STAT5A/B Y694 AVDGY*VKPQIK 0.033 0.100
9364 STAT6 Y641 GY*VPATIK 0.018 0.055
4370 ERK1 T202/Y204 IADPEHDHTGFLT*EY*VATR 0.047 0.142
4370 ERK2 T185 VADPDHDHTGFLT*EYVATR 0.254 0.763
4370 ERK2 T185/Y187 VADPDHDHTGFLT*EY*VATR 0.033 0.098
3270 Jun S73 LAS*PELER 0.021 0.063

LLOD 和 LLOQ 均根据空白限、空白样品方差以及最低水平添加样品的方差确定。

如果我们没有你寻找的测定法,我们会很乐意为你开发。CST 蛋白质组专家会与你一起定义某个定制测定法。CST 随后会在内部开发和验证该测定法。如果你对我们目前没有提供的某个靶标感兴趣,我们可以与你合作来开发某种具有 CST 抗体出名特异性和敏感性的定制抗体。也可以使用外部开发的抗体。

实验反应曲线

免疫 PRM 反应曲线数据

磷酸化 STAT6 (Y641) 肽 GY*VPATIK 的线性(顶部)和对数空间(底部)免疫-PRM 反应曲线数据。在 100 µg 胰蛋白酶肽背景下,对数量递增的 10 重同位素标记合成肽进行免疫沉淀,以进行多点实验,其中肽来源于乳腺癌细胞系 SKBR-3,加入的轻链肽作为内部标准品。在免疫沉淀之后,在 Q Exactive™ 质谱仪上分析肽。通过提取 Skyline 中的片段肽面积来确定肽丰度。通过计算每条肽的 3-6 个丰富片段离子的峰面积比(重链/轻链)来进行定量。目前的结果图显示了一条磷酸肽的代表性数据,同时进行了一个含 10 个靶标的多重 PRM 实验。误差条表示三次捕获和 PRM 重复次数的最大和最小峰面积比。反应曲线表明磷酸肽 GY*VPATIK 中超过 4 个数量级的线性范围,LLOQ 为 0.039 fmol/100 µg。

实验可重复性

免疫 PRM 可重复性数据(5 天)

CDK1/2/3 (Y15) 中磷酸肽 IGEGTY*GVVYK 的免疫 PRM 可重复性数据(5 天)。在 100 µg 胰蛋白酶肽背景下,加入三个水平(500 fmol、20 fmol、0.8 fmol 作为高、中、低水平)的 10 重同位素标记肽来制备样品,其中肽来源于乳腺癌细胞系 SKBR-3,加入的轻链肽作为内部标准品。分 5 个不同天数单独进行三次富集,以测量可重复性。在免疫沉淀之后,在 Q Exactive™ 质谱仪上分析肽。从 Skyline 中提取每条肽的 3-6 个丰富片段的峰面积,并根据轻链和重链肽的片段总和来计算峰面积比。测量起始浓度不同的每条肽的平均实验内和实验间变异系数 (CV)。总 CV 为实验内和实验间 CV 的平方和的平方根。对于结果图中所示的磷酸肽 IGEGTY*GVVYK,所有 CV 均在 10% 之内。对于含 10 个靶标的多重 iPRM 实验中的其他肽,所有 CV 均在 20% 之内。

平均实验内(之内,天)CV 平均实验之间(之间,天)CV 总 CV √(实验内 CV²+ 实验间 CV²)) n =
6.0% 5.2% 7.5% 7% 7% 5% 9% 9% 9% 15 15 15
Powered by Translations.com GlobalLink OneLink SoftwarePowered By OneLink