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验证组蛋白修饰抗体

靶向组蛋白修饰的抗体可非特异性地结合类似但脱靶的组蛋白修饰。相反,周围残基上修饰所引起的位阻会抑制它们的特异性结合。ELISA、蛋白质印迹法、ChIP 和免疫荧光法等测定法通常用来证实抗体的特异性和敏感性,但它们无法清楚地预测抗体如何与周围表位相互作用。因此,在尝试用来验证抗体对某个组蛋白修饰靶标的反应时,它们的使用受到了限制。

鉴于这些原因,使用类似于 Fuchs、S.M. 等所述的肽芯片测定法来验证 CST 修饰特异性组蛋白抗体。(1). 在单个实验中,这些芯片可评估所有组蛋白中对已知修饰的反应性,以及周围修饰对抗体检测单个修饰位点的能力的影响。因此,肽芯片测定法可让我们确认抗体是否按预期起作用。

芯片

如图所示,将含有单甲基化、二甲基化、三甲基化、乙酰化或未修饰赖氨酸的肽单独或与已知周围组蛋白修饰(如组蛋白 H3K4Me3 和 H3T3Phos)一起转移到硝酸纤维素上成为印迹。使用类似芯片来检测甲基化精氨酸抗体。

组蛋白抗体浓度

抗体

如图所示,按三种浓度对芯片应用组蛋白修饰抗体。这能让我们评估抗体反应性,同时确保抗体浓度不会使检测浓度饱和。

分析

芯片洗涤后使用荧光标记的二抗进行孵育,随后使用 LI-COR® Odyssey® Infrared Imager 读取。

请点击下面来查看我们对组蛋白修饰抗体进行分析的例子。

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