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抗体验证标志多种抗体策略

多种抗体策略是一种强大的抗体验证方法。实现此目标的最常见方法之一是使用一种抗体进行靶标的免疫沉淀 (IP),然后通过用另一种针对相同靶标的抗体进行蛋白质印迹分析检测。这能确定两种抗体结合正确的生物分子。

多种抗体验证的另一种熟悉方法涉及使用针对同一靶标上不同、不重叠表位的两种或多种抗体,以产生直接可比的免疫染色数据。这通常通过蛋白质印迹,免疫细胞化学或免疫组织化学等技术来证明。通过平行地用多种抗体检测相同的样品,可以相对快速直观地了解抗体特异性。

在没有两种针对同一靶标的抗体的情况下,可以采用其他策略来确定抗体特异性。例如,免疫沉淀联合随后的质谱分析方法越来越多地用于检测经过评估中抗体富集的蛋白。

跟采用抗体验证标志的其他任何一种一样,多种抗体策略绝不应成为确定抗体特异性的唯一策略。例如,免疫组织化学检测的抗体结合可比,但实际上两种试剂均识别相同的不正确、非靶标生物分子,为消除这种可能性,应始终通过其他抗体验证策略来支持多种抗体检测数据。此外,不应以“盲法”方式使用多种抗体方法作为筛选或选择抗体的手段;所有测试这种方法的抗体都应使用本手册中概述的其他策略独立验证。

免疫沉淀

免疫沉淀是多种抗体验证最显而易见的方法之一,明确地直观显示两种不同的抗体结合同一个靶标。如果抗体识别分子的不同区域,则证据最充分,如图 1 所示。€‚在这里,NeuN (E4M5P) 小鼠单克隆抗体已用于免疫沉淀大鼠脑提取物的 NeuN 蛋白,NeuN (D4G4O) 兔单克隆抗体已用于蛋白质印迹分析。图2 显示了类似的数据集,其中 TAZ (EBE9G) 兔单克隆抗体用于免疫沉淀,第二种 TAZ (D316D) 兔单克隆抗体用于免疫印迹。在这两种情况下,加入同种型对照均有助于确认抗体的特异性。

对大鼠脑组织提取物的 NeuN 蛋白进行免疫沉淀。泳道 1 为 10% input,泳道 2 为 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #,泳道 3 为 NeuN (E4M5P)。使用 NeuN (D4G4O) 进行蛋白质印迹分析。

图 1. 对大鼠脑组织提取物的 NeuN 蛋白进行免疫沉淀。泳道 1 为 10% input,泳道 2 为 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #,泳道 3 为 NeuN (E4M5P)。使用 NeuN (D4G4O) 进行蛋白质印迹分析。

对 HeLa 细胞提取物的 TAZ 蛋白进行的免疫沉淀。泳道 1 为 10% input,泳道 2 为 Rabbit (DA1E) Isotype Control,泳道 3 为 TAZ (E8E9G)。使用  TAZ (D3I6D) 兔单克隆抗体 # 进行蛋白印迹分析。

图 2。 对 HeLa 细胞提取物的 TAZ 蛋白进行的免疫沉淀。泳道 1 为 10% input,泳道 2 为 Rabbit (DA1E) Isotype Control,泳道 3 为 TAZ (E8E9G)。使用 TAZ (D3I6D) 兔单克隆抗体 # 进行蛋白印迹分析。

检测不同抗原

通过免疫染色技术使用多种抗体检测相同样本是确认抗体特异性的简单但未充分利用的方法。如果两种或多种不同的抗体试剂显示出相同的染色模式或抗原定位,则可以确信抗体正在特异性地对靶标进行染色。

可以使用先前验证的抗体来确认从正在验证的抗体中观察到的免疫染色数据。如果采用测试抗体获得的结果可重现经过验证的抗体的结果,则这被视为特异性的指标。例如,图 3 显示了采用可识别人蛋白质上不同表位的两种 Helios 兔单克隆抗体进行的两种不同组织类型的免疫组织化学分析。两种组织中的染色模式相当,表明两种抗体都对靶标具有特异性。在 图 4 中,使用两种不同的 MAGE-A4 兔单克隆抗体对人鳞状细胞肺癌染色。再次,两种抗体都可以看见类似染色,为它们的特异性提供可信度。

除了提供可识别同一靶标上不同表位的两种抗体的平行数据外,理想的情况是在多种产品中查找可比数据。例如,图 56 显示与两种不同的抗 CD200 抗体相关的蛋白质印迹数据相似,突显了用于检测抗体的模型一致性和产生结果的相似性。相反,如果针对同一靶标的两种不同产品的数据差异很大,则结果的有效性可能会受到质疑。

使用 Helios (E4L5U)(上图)或 Helios 抗体(下图)对石蜡包埋的人 B 细胞非霍奇金氏淋巴瘤(左图)或前列腺癌(右图)细胞进行免疫组织化学分析。这两种抗体可检测人 Helios 上的独立、独特表位。使用两种抗体获得的相似染色模式有助于确认染色特异性。

图 3。 使用 Helios (E4L5U)(上图)或 Helios 抗体(下图)对石蜡包埋的人 B 细胞非霍奇金氏淋巴瘤(左图)或前列腺癌(右图)细胞进行免疫组织化学分析。这两种抗体可检测人 Helios 上的独立、独特表位。使用两种抗体获得的相似染色模式有助于确认染色特异性。

使用 MAGE-A4 (E7O1U)(上图)或 MAGE-A4 Antibody(下图)对石蜡包埋的人鳞状细胞肺癌进行免疫组织化学分析。这两种抗体可检测人 MAGE-A4 上的独立、独特表位。使用两种抗体获得的相似染色模式有助于确认染色特异性。

图 4。 使用 MAGE-A4 (E7O1U)(上图)或 MAGE-A4 Antibody(下图)对石蜡包埋的人鳞状细胞肺癌进行免疫组织化学分析。这两种抗体可检测人 MAGE-A4 上的独立、独特表位。使用两种抗体获得的相似染色模式有助于确认染色特异性。

使用 CD200 (E5I9V)(上图)或 β-Actin (D6A8)(下图)对不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。

图 5。 使用 CD200 (E5I9V)(上图)或 β-Actin (D6A8)(下图)对不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。

使用 CD200 (E2K4C)(上图)和 β-Actin (D6A8)(下图)对不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。

图 6。 使用 CD200 (E2K4C)(上图)和 β-Actin (D6A8)(下图)对不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。

染色质免疫沉淀法

也可使用多种抗体验证染色质免疫沉淀 (ChIP) 实验结果。ChIP 用于识别与体内特定染色质片段结合的蛋白质,例如转录因子和辅助因子,可用于探测细胞天然染色质环境中的蛋白质-DNA 相互作用。通过使用针对同一靶蛋白的非重叠表位的多种抗体,或针对同一 DNA 结合复合物中不同靶蛋白的多种抗体,并且将 ChIP 与 qPCR 或 NG-seq 联合分析,研究人员j就能从一种用途广泛的抗体交叉验证方法中受益。

图 7 显示了使用针对 SW1/SNF 复合物中三种不同蛋白质靶标的三种抗体 SMARCC1、SMARCB1 和 SS18 进行实验所得的 ChIP 数据。经过 ChIP 和随后的 NG-seq 分析,可以看出所有三种抗体均产生非常相似的结果。

使用 SimpleChIP® Plus 酶解试剂盒 (磁珠法) # 对在无酚红的培养基和 5% 活性炭剥离的 FBS 中生长 4 天,随后使用 β-雌二醇(10 nM,45 分钟)处理的 MCF7 细胞的交联染色质与 SMARCC1/BAF155 (D7F8S)、SMARCB1/BAF47 (D8M1X) 或 SS18 (D6I4Z) 进行染色质免疫沉淀。DNA 库用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® 制备。SMARCC1/BAF155、SMARCB1/BAF47 和 SS18 均为 SWI/SNF 复合体的所有亚基。结果图显示了 pS2/TFF1 内结合,pS2/TFF1 是一种已知的 SWI/SNF 靶标基因。

图 7。 使用 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) # 对在无酚红的培养基和 5% 活性炭剥离的 FBS 中生长 4 天,随后使用 β-雌二醇(10 nM,45 分钟)处理的 MCF7 细胞的交联染色质与 SMARCC1/BAF155 (D7F8S)、SMARCB1/BAF47 (D8M1X) 或 SS18 (D6I4Z) 进行染色质免疫沉淀。使用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® 制备 DNA 库。SMARCC1/BAF155、SMARCB1/BAF47 和 SS18 均为 SWI/SNF 复合体的所有亚基。结果图显示了 pS2/TFF1 内结合,pS2/TFF1 是一种已知的 SWI/SNF 靶标基因。

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