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使用免疫荧光法验证抗体

免疫荧光法 (IF) 涉及使用特定一抗和荧光素偶联的二抗来标记细胞蛋白(间接法)或使用直接偶联的一抗进行标记(直接法)。多数荧光显微镜可用于检测单份样品中两种或三种荧光标记蛋白的亚细胞定位、相对表达水平和/或激活状态(如磷酸化状态)。在使用多种标记物对某种组织中的许多细胞进行研究时,能够进行复路分析的能力可避免对连续切片的需要,从而节省了时间和试剂。Cell Signaling Technology (CST) 的科学家们已经在免疫荧光应用中验证了超过 800 种激活状态特异性(如磷酸化特异性)和总蛋白抗体,如手动荧光显微镜或自动化显影和激光扫描高内涵平台。所有获批用于免疫荧光测定法的 CST™ 抗体已经过严格的验证过程。

验证步骤包括

  • 使用已知靶标表达水平的细胞系或组织来验证特异性。
  • 使用相应的细胞系和组织来验证亚细胞定位。
  • 以相应组织评估抗体性能。
  • 对细胞进行磷酸酶处理,以验证磷酸化特异性。此外,使用已知敲除或缺失的细胞系来验证靶标特异性。
  • 对细胞进行 siRNA 处理或让靶蛋白过表达,以验证靶标特异性。
  • 使用配体或抑制剂来调节通路活性,从而检测激活状态特化、靶标表达和转位。
  • 抗体信噪比阈值的要求:对磷酸化特异性抗体进行同型比较和最低倍性诱导,从而确保最大可能的敏感性。
  • 优化固定和通透条件;如有必要,建议使用备选实验步骤。
  • 严格检测可确保批间一致性。
阳性/阴性细胞系

使用 AGR2 (D9V2F) XP® Rabbit mAb #13062(绿色)和 β-Actin (8H10D10) Mouse mAb #3700(红色)对 MCF7 细胞(阳性,左图)和 IGROV-1 细胞(阴性,右图)进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。

激活剂 / 抑制剂处理

使用 NF-κB1 p105/p50 (D4P4D) Rabbit mAb #13586(绿色)对未经(左图)或已经 Mouse Tumor Necrosis Factor-α (mTNF-α) #5178(20 ng/ml,30 分钟,右图)处理的 C2C12 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白纤丝用 DyLight™ 554Phalloidin #13054(红色)标记。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。

对相应组织评估 Pdx1 Antibody #2437 的性能。

Pdx1 Antibody #2437:使用 Pdx1 Antibody #2437(绿色,上图)或 Insulin (C27C9) Rabbit mAb #3014(绿色,下图)对正常大鼠胰腺细胞进行共聚焦免疫荧光分析。角蛋白纤丝用 Pan-Keratin (C11) Mouse mAb (Alexa Fluor®647 Conjugate) #4528(蓝色)标记。红色 = 碘化丙啶/RNase #4087(DNA 荧光染料)。

对相应组织评估 PDI #2446 和 β-Actin #3700 的性能。

PDI Antibody #2446β-Actin (8H10D10) Mouse mAb #3700:使用 #2446(绿色)和 #3700(红色)对经甲醇(上图)或 0.3% Triton X-100(下图)通透处理的 NIH/3T3 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。

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