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细胞增殖、代谢状态和细胞死亡概要

细胞活力的指标是什么?

细胞活力是一个群体中健康活细胞比例的指标。细胞活力检测用于确定细胞的总体健康、优化培养或实验条件,以及测量经化合物处理后的细胞存活(如药物筛选时)。

通常,细胞活力检测通过测量代谢活性、ATP 含量或细胞增殖来提供细胞健康的读数。细胞活力也可以通过细胞毒性检测进行评估,这些检测可提供细胞死亡标志物(如膜完整性丢失)的读数。

细胞活力和细胞毒性检测结合使用,是评估细胞对目标实验化合物的应答状况的重要工具。

细胞增殖作为细胞活力指标的作用

细胞增殖检测可以直接测量细胞分裂事件(细胞计数)或使用细胞分裂/DNA 复制的标志物(例如 DNA 含量)。

什么是细胞增殖

细胞增殖是指细胞分裂(细胞质分裂)引起的细胞数量增加,是细胞周期的最后一步。健康细胞活跃增殖,而生长停滞、衰老以及死亡或濒死细胞则不会增殖。因此,通过提供样本中活跃分裂细胞数量的读数,细胞增殖检测成为评估细胞活力或细胞存活的有用工具。

如何测量细胞增殖

细胞增殖检测通常测量复制细胞中的 DNA 含量或 DNA 合成。细胞增殖检测采用标准方法进行,包括酶联免疫吸附 (ELISA)、流式细胞术、免疫荧光和高内涵成像。

细胞周期检测—DNA 含量分析

细胞周期检测法通过流式细胞术确定细胞周期不同阶段的细胞比例。在细胞周期进展时,细胞大小增加(G1 期),随后是 DNA 合成和复制(S 期)、进一步生长(G2 期),最后是有丝分裂(M 期)和细胞分裂。退出细胞周期并停止分裂的细胞会维持静息状态 (G 0),即休眠期。

细胞周期各阶段

细胞周期各阶段。 G1 - 大小增加;S - DNA 合成和复制;G2 - 生长;M - 有丝分裂和细胞分裂;G0 - 休眠期。

在细胞周期检测时,先对细胞进行固定或通透,再用 DNA 插入剂如碘化丙啶 (PI) 孵育,然后通过流式细胞术进行分析。PI 信号的荧光强度差异与细胞周期的不同阶段相关。例如,G2 或 M 期细胞的 DNA 含量是 G0 或 G1 期细胞的两倍,与荧光信号增加相对应。S 期细胞的荧光强度则在 G0/G1 和 G2/M 期细胞的荧光强度之间变动。低于 G0/G1 期峰值的荧光信号通常与具有片段化 DNA 的凋亡细胞量相对应。

增殖检测—DNA 合成分析

在 S 期,核苷标记试剂(如 3H-胸苷或 5-溴-2'-脱氧尿苷)(BrdU) 能够掺入到新合成的 DNA 中。试剂掺入水平与目标群体中的细胞分裂数量成比例。3H-胸苷掺入检测法需要使用放射性,而 Brdu 掺入法可通过在 ELISA、流式细胞术或 IF-IC 应用中使用抗 BrdU 抗体进行检测,无需使用放射性同位素标记。

通过 BrdU 进行细胞增殖检测

C2C12 细胞按不同密度接种在 96 孔板的无血清培养基中,并孵育过夜。按不同浓度往平板上添加血清,并孵育细胞 24 小时。最后,往平板中加入 10 μM BrdU,并孵育细胞 4 小时

增殖蛋白检测

与休眠或衰老细胞相比,分裂细胞具有较高的细胞周期蛋白表达,因此可检测细胞周期特异性蛋白水平,作为细胞增殖的读数。一些常见的增殖蛋白包括 增殖细胞核抗原 (PCNA)KI67磷酸化组蛋白 H3,可使用蛋白质印迹法 (WB)、IF、IHC、流式细胞术和 ELISA 进行检测。

Ki-67 IHC

使用 Ki-67 (8D5) Mouse mAb 对石蜡包埋的人乳腺癌进行免疫组织化学分析。

衰老表明增殖受损

功能失调的复制可导致衰老,衰老细胞不会因生长信号的诱导而分裂。因此,衰老标志物可作为细胞增殖检测的补充。细胞增大、pH 依赖性 β-半乳糖甘酶活性表达以及基因表达模式改变是衰老细胞的进一步特征,可用于辅助细胞增殖的评估。

SA-β-半乳糖苷酶检测

pH 为 6.0 时,对未处理的 MCF-7 细胞(左图)和经依托泊苷 #2200( 12.5 μM,24 小时)处理并恢复 4 天的衰老 MCF-7 细胞(右图)进行 β-半乳糖苷酶染色。

细胞活力

细胞活力检测用于确定样本中健康细胞的数量。除了上述增殖检测以外,其他细胞活力检测则报告群体的总体健康,而不对分裂细胞与非分裂细胞进行区分。

如何测试细胞活力

最常用于细胞活力读数的是活体染料,例如碘化丙啶,但细胞活力检测通常还测量健康细胞的代谢活性或 ATP 含量。

代谢检测如 MTT 和 XTT 检测 通过测量线粒体酶介导的比色底物减少来量化细胞健康。MTT 检测法可量化活细胞的相对数量。培养物用黄色四唑染料 MTT (3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐) 孵育,该染料在健康细胞中可被线粒体酶转化为不溶性紫色甲臜产物。然后经过去垢剂或异丙醇溶解,通过在微孔读板机中测量 450 nm 处的吸光度来确定活细胞数量。XTT 细胞活力检测是 MTT 检测的一种替代方法,其生成的甲臜产物可溶于水溶液,因此无需额外的溶解步骤。

XTT 检测评估细胞活力

C2C12 细胞按不同密度接种在 96 孔板上,并孵育过夜。平板中加入 XTT 检测溶液来孵育细胞。在 1.0、2.0、3.0、4.0 和 5.0 小时测量在 450 nm 处的吸光度。

ATP 测量方法通过量化 ATP 含量确定样本中代谢活跃的活细胞数量。这些检测在多孔板中进行,得到需要 ATP 的代谢活性的比色、荧光或发光读数,检测中的底物产生量与含有活跃线粒体的健康细胞数量成比例。

细胞毒性

细胞毒性是指物质损坏或杀死细胞的能力。可以通过量化细胞死亡标志物(例如膜完整性丢失)的检测方法直接评估细胞毒性。也可以使用上述细胞活力检测方法间接评估细胞毒性。

细胞毒性检测是在药物或其他应激物处理后评估细胞存活的有用工具,也可用于在 T 细胞杀伤检测中检查化合物对免疫细胞介导的肿瘤细胞杀伤的影响。

什么是细胞毒性?

细胞毒性是指物质损坏或杀死细胞的能力。

如何检测细胞毒性

多种细胞毒性(细胞毒性)检测方法可供使用,这些方法可提供细胞死亡或细胞健康受损的不同指标。

活细胞/死细胞计数用于测量样本群体中的活细胞和死细胞数量。例如,台盼蓝染料排斥法的原理是,只有细胞膜受损的死亡或濒死细胞会摄取台盼蓝,因此可使用血细胞计数器对死细胞(蓝色)或活细胞(无色)进行计数。

细胞健康检测是一种基于荧光的检测方法,用于活细胞/死细胞计数,荧光显微镜和流式细胞术分析法均适用。检测时通过钙黄绿素-AM 转化为钙黄绿素检测活细胞,通过碘化丙锭摄取检测死细胞。还可以使用活细胞成像平台实时监测细胞死亡。

评估细胞膜完整性可用于确定细胞膜损坏或破裂是否由原发性坏死或凋亡后继发性坏死引起。膜损伤导致细胞质内容物释放到细胞外间隙内,其中包括乳酸脱氢酶 (LDH)。可使用比色法分析细胞外 LDH 量,检测中形成的产物量与样品中死亡或受损细胞的数量相关。还可通过分析膜不通透染料(如碘化丙啶)的摄取来评估细胞膜完整性。

碘化丙啶/钙黄绿素-AM 检测评估细胞活力

使用 Cell Health Assay Kit 检测发现,HeLa 细胞(4 x104 个细胞/孔)用浓度递增的特非那定处理(4 小时)会导致细胞活力降低。

T 细胞杀伤检测用于检查试验化合物对免疫细胞介导的培养肿瘤细胞杀伤的影响。细胞毒性 T 细胞是一类识别并破坏病毒感染细胞和肿瘤细胞的 T 细胞。在 T 细胞杀伤检测中,首先用报告基因标记靶肿瘤细胞,以便识别活细胞和死细胞。然后将试验化合物和细胞毒性 T 细胞添加到培养物中,使用活细胞成像或流式细胞术监测肿瘤细胞活力。

凋亡

凋亡是一种程序性细胞死亡,为多细胞生物的适当生长、发育和体内稳态所必需,但也可以由细胞应激所引起。凋亡与坏死、坏死性凋亡以及细胞焦亡等细胞死亡不同。在凋亡过程中,细胞出现特征性的皱缩、膜起泡、核断裂和染色质凝聚。细胞碎片被包裹成为凋亡小体,然后被吞噬细胞吞噬和消化。

凋亡由一类称为 caspase 的蛋白水解酶所介导,这些酶可通过内源性(线粒体膜电位丧失和细胞色素 C 释放)或外源性(配体与死亡受体结合)凋亡信号转导机制激活。有关凋亡通路和调控的更多详细信息请点击这里

凋亡调控

为何会发生细胞凋亡?

凋亡通常发生在生长和发育过程中,以清除不再需要或对机体潜在有害的细胞,例如病毒感染细胞或具有受损 DNA 的细胞。凋亡失调与疾病相关,如凋亡水平升高与自身免疫性和神经退行性疾病有关,凋亡水平降低见于多种癌症。

通过使用可结合死亡受体(包括 TNF-R1 和 TNF-R2)的配体或者促凋亡化学剂(例如星形孢菌素或依托泊苷)来孵育细胞能够实验性诱导凋亡。

死亡受体通路

凋亡、坏死和坏死性凋亡/细胞焦亡有何区别?

凋亡是一种程序性细胞死亡,坏死是指由急性损伤或感染引起的非程序性细胞死亡。在坏死过程中,细胞质和细胞器肿胀导致细胞膜完整性丧失,最终细胞裂解,导致细胞内容物释放到细胞外间隙中。坏死性细胞死亡会激活周围区域的炎症反应,而凋亡性细胞死亡则不会。继发性坏死常发生于出现广泛凋亡的细胞群体中。

虽然坏死通常被视为非程序性细胞死亡机制,但已发现一种受调节的细胞坏死形式,被称为坏死性凋亡。坏死性凋亡提供了一道抗病毒防线,在感染时通过 caspase 依赖性方式杀死感染细胞,从而阻断凋亡机制。这种通路也可被促炎症信号转导和缺血性损伤所激活。

细胞焦亡是一种 caspase-1 介导的裂解型细胞死亡,通常发生在免疫细胞中,作为对微生物或病毒感染的应答。

如何检测凋亡

凋亡检测用于量化出现凋亡的细胞数量。例如检测 annexin V与暴露的膜脂质结合、caspase 激活、染色质凝聚、DNA 片段化或细胞色素 C 释放。

Annexin V 检测

在凋亡过程中,随着磷脂酰丝氨酸 (PS) 从质膜内侧面转位至外侧面,膜的不对称性或不同脂质在质膜两侧的不规则分布受到破坏。PS 在外侧面的存在会发出吞噬细胞吞噬和降解的信号。通过使用流式细胞术、IF 或 ELISA,暴露的 PS 可被荧光团偶联的 annexin V 识别,作为凋亡的早期标志物。

Annexin V - FITC Early Apoptosis Detection

使用 Annexin V-FITC Early Apoptosis Detection Kit 对未经处理(左图)或经喜树碱(10uM,4 小时;右图)处理的 Jurkat 细胞进行流式细胞分析。

Caspase 检测

在凋亡启动和执行期间,caspase 酶从无活性的酶原加工为活性蛋白酶。启动型 caspases-8 和9 激活诸如 caspase-3 的执行型 caspase。Caspase-3 剪切可通过蛋白质印迹法、IF、IHC 或流式细胞术检测,作为凋亡的指标。Caspase-3 活性 和剪切型 PARP 等 caspase 底物也可以使用类似于剪切型 caspase-3 的方法或 ELISA 进行测量,其中底物处理程度与样品中凋亡细胞的数量成比例。使用针对其他活化 caspase 的抗体可对凋亡通路进行进一步检查。

Caspase-3 剪切检测

使用 Caspase-3 Antibody(上图)或 Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody(下图)对未经处理、经星形孢菌素处理(3 小时,1 µM,体内)或经细胞色素 C 处理(1 小时,0.25 mg/ml,体外)的 HeLa、NIH/3T3 和 C6 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。

Caspase-3 活性检测

NIH/3T3 细胞用 Staurosporine #9953(5 μM,5 小时)处理,随后在 PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer (1X) #7018(试剂盒中提供)中进行裂解。

染色质凝聚

凋亡细胞的典型形态学特征是核染色质从异质状态凝聚成压缩状态。染色质凝聚可使用核染色剂和 IF 或流式细胞术进行观察。用核染色染色时,凋亡细胞由于存在凝聚的染色质,从而具有更强的荧光信号。

TUNEL 检测

DNA 链断裂和 DNA 片段化是晚期凋亡的特征,可使用末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT) dUTP 缺口末端标记(TUNEL 检测)进行检测,通过 IF、IHC、读板机或流式细胞术量化群体中凋亡细胞的数量。TdT 酶催化标记的 dUTP(例如与荧光基团或生物素偶联的 dUTP)掺入到 DNA 双链断裂处。凋亡细胞或具有 DNA 损伤的其他细胞可被修饰的 dUTP 标记,而健康细胞则不会。也可使用标准凝胶电泳观察来自凋亡细胞的片段化 DNA,因为与来自健康细胞的完整 DNA 相比,片段化 DNA 呈阶梯状。

细胞色素 C 释放检测

凋亡刺激会触发细胞色素 C 从线粒体转位到细胞质。可采用细胞分离法将线粒体与细胞质分开,然后用针对细胞色素 C的抗体进行免疫印迹。

如何检测坏死和坏死性凋亡/细胞焦亡

坏死性细胞死亡的主要特征是细胞膜完整性丧失,导致细胞内容物释放到细胞外间隙中,可以使用胞内和分泌标志物(例如 HMGB1、LDH 和 IL-1β)进行检测。

坏死性凋亡是一种基因程序化的坏死形式,其特征是坏死小体(包含 RIP 和 RIP3 激酶的蛋白复合体)的形成。可通过检测它们以及相关的 坏死性凋亡相关蛋白(例如 MLK1)的表达或翻译后修饰来评估坏死性凋亡。

针对微生物感染会形成炎症小体,启动 caspase 1 依赖性细胞焦亡。Caspase 1 介导的剪切导致促炎症细胞因子 IL-1β 和 IL-18 激活。Caspase-1 还剪切gasdermin D,导致 N 末端片段的寡聚化,形成膜孔,使得 IL-1β、IL-18 和其他 DAMP 分泌。

RIP 是评估坏死性凋亡的常用标志物

使用 RIP (D94C12) XP® Rabbit mAb(绿色)对 OVCAR8 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。

选择评估细胞存活的最佳方法

测量细胞存活的最佳检测方法取决于多种因素,包括实验背景和待研究的细胞群体。可能需要多种独立的检测来确认实验结果。

选择评估细胞存活的最佳方法的考虑因素

细胞类型 - 在分裂细胞中进行的实验可用于存活分析,可通过评估细胞增殖、代谢活性或膜完整性丧失的检测方法进行。对于有丝分裂后或非分裂细胞(例如神经元),代谢或膜完整性检测是最佳选择。为了实现最佳检测性能,并确保得到可重现的结果,应对平板接种密度和培养条件进行标准化规定。

时间 - 在选择细胞活力或毒性检测时应考虑实验时间过程,因为细胞存活可能会受到处理持续时间的影响。另外,细胞死亡的一些标志物可能只存在于凋亡过程中的特定阶段,例如 PS 转位发生于凋亡早期,DNA 片段化发生于凋亡晚期。

细胞死亡机制 - 虽然标准的细胞活力和细胞毒性检测能够提供样本中活细胞或死细胞的定量数据,但它们不会提供实验背景下细胞死亡机制的深入了解。有必要通过使用针对细胞死亡通路(例如凋亡)的检测方法的靶向实验来阐明细胞死亡的准确机制。

检测判读 - 实验化合物可能不会诱导细胞死亡,而是改变细胞代谢或细胞增殖,这可能会被错误判读为活力降低。应务必将细胞活力和细胞毒性检测相结合以区分这些可能性。

通过流式细胞术检测细胞活力

多种细胞活力检测可通过测量增殖或代谢活性间接报告细胞死亡,而流式细胞术能够直接鉴别样本中的活细胞和死细胞。通常使用碘化丙啶等膜不通透染料来鉴别膜受损的死亡或濒死细胞,使用钙黄绿素-AM 等活性染料来标记活细胞。

碘化丙啶/钙黄绿素-AM 检测评估细胞活力

使用 Cell Health Assay Kit 检测发现,HeLa 细胞(4 x104 个细胞/孔)用浓度递增的特非那定处理(4 小时)会导致细胞活力降低。

免疫组织化学 (IHC) 检测细胞活力

免疫组织化学 (IHC) 使用抗体检测表达特异性抗原的组织样本中的细胞群体。这种方法通常用于鉴定发育过程中蛋白质的时间分布,分析疾病组织相比于健康组织中的蛋白质表达模式,以及基于生物标志物表达区分各种细胞类型。IHC 还可通过分析组织样本来测量背景中的细胞存活。例如,可通对量化表达增殖标志物(例如 Ki67PCNA)的细胞数量来评估细胞活力,这在确定治疗对肿瘤细胞增殖的影响时尤其具有相关性。除了 TUNEL 检测外,还可以使用针对剪切型 caspase-3 和剪切型PARP 的抗体来染色组织,从而鉴别凋亡细胞。

Ki67 经常用作细胞增殖的标志物

使用 Ki-67 (8D5) Mouse mAb 对石蜡包埋的人卵巢浆液性腺癌进行免疫组织化学分析。

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