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酶联免疫吸附实验 (ELISA) 概述

什么是酶联免疫吸附实验 (ELISA)?

酶联免疫吸附实验 (ELISA) 是一种定性或定量检测,使用抗体来结合并测定目的分子。与其他免疫检测相似,可使用单克隆抗体和多克隆抗体来检测分析物(如肽、蛋白、抗体和小分子)。抗体对分析物产生特异性,并且一部分(如辣根过氧化物酶 [HRP])直接或间接偶联抗体,从而提供检测方法并实现可能的信号放大。通过多种 ELISA 方法和检测化学成份,可以让终端用户调整适当的检测,以解决预计的实验问题。该方法可以用于单份样品检测或高通量筛选。

ELISA 方法和原理

实验设置将根据所使用的具体 ELISA 类型有所不同(见下文有关各类 ELISA 的详细说明)。其中一种最简单的 ELISA 形式是从将目的抗原固定在一个固体表面开始。这通常用一块能够被动结合蛋白的 96 孔或 384 孔板完成。通过偶联某种酶来制备相应抗体。添加这种偶联物到样品中即可让抗体结合抗原。对目的抗原不具特异性的结合物质可以随后用洗涤步骤去除。随后添加酶的底物,以让溶液中的底物与连接抗体的酶发生反应,最终产生颜色、荧光或发光变化,读取这种变化即可测定每份样品中靶标的数量。

ELISA 用来检测和测定什么?

ELISA 是一种间接检测抗体与抗原结合的方法。检测质量在很大程度上取决于抗体对抗原的特异性。如果特异性较差,便会有较高的非特异性背景。如果结合有特异性但非常微弱,那么通过洗涤步骤去除一些抗体,导致产生错误的弱信号。检测这种结合是间接的,因为信号是偶联抗体的酶所产生的。这是一种相对信号,并且可能取决于孵育时间和温度。在适用的情况下,通过标准曲线可实现定量。

ELISA 应用

ELISA 可用来定量一份检测样品中的一种或多种抗原。鉴于抗体试剂的特异性以及检测的简易性,ELISA 通常被视为生物样品定量检测的金标准。在生物医学/生物化学领域,使用抗体-抗原结合连同信号放大的 ELISA 原理的检测非常普遍。在研究实验室,这些检测可用来定量蛋白水平或通路激活。在临床上,ELISA 有各种用途,包括测定患者血清样品中药物治疗的生物标记物或细胞因子水平。ELISA 还适用于植物生物学,并且可用于检测农作物过敏原。

将 ELISA 用作一种研究工具

在多种研究领域都会用到 ELISA 平台。它能特异并灵敏地检测抗体,因此是一种方便的生物发现工具。它在所有生物研究领域中被广泛用来检测和定量目的抗原。这类抗原会被分泌成细胞培养基、某种细胞中的总蛋白,或细胞信号转导期间发生的翻译后修饰 (PTM)。

将 ELISA 用作一种诊断工具

除了用于研究之外,ELISA 还广泛用于诊断检测,包括对病毒感染、食物过敏原、毒性和癌症的诊断检测。用抗体检测感染性病毒是一种快速的临床检测,这种检测在扩展后可同时检测多份样品。这些检测通常在血清或血样上完成,但也可以使用细胞或组织的裂解物进行。

ELISA 的优势

ELISA 检测通常使用基础混合物、洗涤实验步骤和简单的设备,这使它们易于在实验室进行。关键试剂(抗体)会特异性结合其靶标,脱靶率很低,这可产生高敏感性和高特异性结果。此外,数据分析通常非常简单,数据可以是定量或定性数据,具体取决于实验设置,并且结果明确,易于解释。

实验室 ELISA 检测所需设备通常可以在多数研究和临床实验室中找到(能够测定吸光度、荧光和/或化学发光的读板机)。对于其他应用,读取的可以是彩色的点或线。ELISA 检测还可以扩展,并且可以借助实验室的 96 孔或 384 孔板、非处方孕检等各种形式。ELISA 检测的另外一个优势是经 ELISA 验证的抗体可以大规模重复,从而可为长期使用提供稳定的试剂来源。

ELISA 方法的类型

ELISA 有多种常用方法类型。根据生物学问题、可用的结合物以及检测方法,会使用这些方法的多种其他衍生方法:

  • 直接 ELISA - 让酶偶联会在表面结合抗原的抗体。
  • 间接 ELISA - 类似于直接 ELISA,但不偶联抗体。使用第二偶联抗体来检测结合的抗体。
  • 夹心 ELISA - 抗原被 2 种抗体识别,形成一种像三明治一样的复合体。一种抗体用来捕获,一种用来检测。检测可以是直接或间接的。
  • 竞争性/抑制性 ELISA - 类似于直接 ELISA,但让抗体竞争性地或抑制抗体结合实测数量的抗原来进行定量。

应注意的是,术语“直接/间接”和“一抗/二抗”在文献中有不同的含义,具体取决于语境。“直接” ELISA 用来表示让抗原直接结合表面,随后用抗体检测。但“直接“还用来描述某种抗体直接结合任何抗原,不管形式如何。“间接” ELISA 术语是直接方法的延伸,但第二抗体结合第一抗体。“间接”更普遍的还指任何用第二抗体(而不是结合目的抗原的抗体)检测的方法。术语“一抗”是指一种抗体与某种抗原的结合。“二抗”通常是任何用来结合一抗以进行检测的抗体。二抗会与碱性磷酸酶 (AP) 或 HRP 偶联。

直接 ELISA

在直接 ELISA 中,抗原直接结合微孔板表面,随后添加直接偶联的抗体来结合/检测。

简而言之,实验步骤的第一步便是将抗原固定在微孔板上。第二步是添加一种封闭试剂,防止检测抗体出现非特异性结合。接下来,添加直接偶联某种酶(如 HRP)的检测抗体。该检测抗体将结合抗原,并且剩余的抗体会从孔中洗掉。随后添加这种酶的底物,短暂孵育后,通常在一个读板机上测定每个孔的信号。

直接 ELISA 的实验步骤有限,可让实验设置整体简化。它的缺点在于需要制备在每个实验中用来检测的各种偶联抗体。另外,包被抗原会非特异性地结合表面,因此它可能会在非天然结构中被呈递给抗体,从而导致更强的背景信号。这种检测方法不适合多种分析。通常,这种方式非常适合测定样品中的抗体量,例如感染后的血清抗体水平。

ELISA 直接检测

ELISA 直接

间接 ELISA

间接 ELISA 类似于直接 ELISA;但主要的差别在于会通过第二偶联抗体来检测结合抗体。实验步骤的第一步便是将抗原固定在微孔板上。第二步是添加一种封闭试剂,防止结合抗体出现非特异性结合。第三,添加一种抗原特异性结合抗体,短暂孵育后,用缓冲液洗涤板孔,以去除多余的试剂。下一步是“间接”检测,其中添加一种抗体来检测第一结合抗体。这种抗体通常偶联某种酶。在孵育和洗涤板孔之后,添加该酶的底物。随后,短暂孵育后,通常在一个读板机上测定每个孔的信号。第二抗体通常是一种抗物种抗体。

这种方案的一个变化在于让检测抗体偶联生物素。添加抗体后,可以添加链霉亲和素-酶偶联物,并像之前一样继续其余的实验步骤

间接 ELISA 的主要优势在于可以使用偶联的第二抗体来进行多个实验,前提是在所有不同的实验中使用相同物种的结合抗体。另一个优势是第二抗体会放大信号,因为大约 2 个抗体将结合第一抗体。随着步骤数量的增加,实验步骤通常会耗时更长,并且更容易出错。此外,背景信号可能会增强,因为所需的试剂数量更多,每一种都可能会出现非特异性结合。

ELISA 间接检测

ELISA 间接

夹心法 ELISA

在夹心 ELISA 中,抗原成为 2 种抗体之间的“三明治”中心。在一种夹心 ELISA 形式中,第一抗体被吸收进入微孔板孔中,在洗涤和封闭后,添加含抗原的样品。添加会结合样品分子另一位点的第二抗体。这种第二抗体通常偶联某种酶,因此它可用来检测。洗涤板孔之后,添加该酶的底物。随后,短暂反应孵育后,通常在一个读板机上测定每个孔的信号。

与直接和间接 ELISA 方法一样,一般的夹心 ELISA 也有一些变化。在检测而不是偶联抗体方面,可添加酶偶联的第三抗体,以检测第二抗体。例如,使用兔抗体来包被微孔板,它结合样品,随后添加第二小鼠抗体,它也结合样品。随后,添加可检测小鼠抗体的酶偶联抗体。进一步的延伸可能是偶联第二抗体生物素,随后可能需要添加链霉亲和素-酶偶联物。

这种方法的进一步延伸涉及偶联两种抗体,一种偶联标签,一种偶联酶。在这种情况下,有一种抗标签抗体被吸收到微孔板上。2 种抗体和样品都一起添加到这个板孔中。标签偶联抗体和样品/酶偶联抗体的夹心结构将通过抗标签抗体结合平板。这种方法会减少实验步骤数量,从而在整体上实现一个更简捷更快速的实验。

在多数情况下,夹心检测更具特异性,因为这种检测需要 2 种抗体来检测目的靶标。这种特异性需要开发适合实验的“匹配组”抗体,但这样的开发工作既费钱,又耗时。

ELISA 捕获检测夹心

ELISA 捕获(夹心)

竞争性/抑制性 ELISA

竞争性/抑制性 ELISA 也称封闭 ELISA,它对干扰预计信号的程度进行定量,以测定分析物的数量。这样做的一个方法是用一种对靶标有特异性的抗体包被平板。靶标可以偶联某种酶,并用于检测。如果实验含有次于最大量的检测靶标,则高浓度的未标记靶标会竞争性地结合,从而减弱信号。这类竞争性实验可用来测定某种特异性分析物的水平。

但如果用分析物包被平板,则使用偶联酶的抗体来进行检测。在这种情况下,可测定血清中的抗体量。

这类 ELISA 可用来检测免疫应答。另外,如果分子对于夹心检测而言太小,这可提供一个有用的定量测定工具。

检测方法

ELISA 检测方法有很多,但在实验室中最普遍的方法是比色、荧光和化学发光法。这些形式的基本方面在于抗体要偶联某种酶(通常是 HRP 或 AP)。在实验步骤的检测步骤期间,添加这些酶的底物,以产生比色、荧光或化学发光信号。这是一种酶法,因此可以让反应继续一段时间,以放大信号,随后让反应停止。在读板机上测定产生的信号。

使用的底物类型取决于多种因素,最突出的是所需的检测灵敏度和信噪比。

比色

最常用的 ELISA 检测类型是比色检测。产生一个可见终点的 AP 或 HRP 底物可长时间保持可靠稳定,使其成为检测化学成份的一个优良选择。底物有很多种,但最常见的是 3,3',5,5'-四甲基联苯胺 (TMB)

每个孔中的显色量用分光光度计读取,样品在彼此之间进行比较,或与用已知分析物浓度制成的标准曲线进行比较。

荧光

AP 和 HRP 的荧光底物可能会产生较强的信号及更宽的动态范围。这些底物多数半衰期较比色底物更短,因此,信号会在一段时间之后减弱。一种更常用的底物是 10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪。但如果用分析物包被平板,则使用偶联酶的抗体来进行检测。在这种情况下,可测定血清中的抗体量。

这类 ELISA 可用来检测免疫应答。另外,如果分子对于夹心检测而言太小,这可提供一个有用的定量测定工具。

化学发光

例如,偶联 AP 或 HRP 的检测抗体还可用于化学发光检测。在这类实验中,如有过氧化物,AP 或 HRP 会氧化鲁米诺,从而在 425 nm 处发光。这种检测类型的优势是动态范围通常更宽,背景信号更弱,因此灵敏度提高。信号不如其他 2 种检测类型稳定,并且必须在产生信号后的短时间内读取。

ELISA 组分

现已开发了多种试剂盒来简化 ELISA 实验,并加速、简化和标准化每种 ELISA 的流程。现已开发试剂来提升特异性、可重复性和灵敏性,并最大程度降低成本。但没有预制试剂盒来评估某种特殊目的靶标时,实验者可以制备平板和必要的试剂。以下是有关一个 ELISA 实验所需的组分的概述。

样品制备

多个样品类型(如血液、尿液和裂解细胞)都常规通过 ELISA 进行分析。样品制备将取决于待解决的特殊问题。在血清中测定分泌蛋白(如细胞因子)的方法可直接使用,或者在某些情况下,至少需要清除步骤。在光谱的另一端,要检测翻译后修饰,这一般需要用含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的缓冲液进行细胞裂解。样品制备会大大地改变实验和实验结果,因此这需要仔细考虑。

缓冲液

一个 ELISA 实验需要多种缓冲液。这些包括包被、封闭、洗涤、稀释、捕获和检测缓冲液。这些缓冲液的基本配方广泛提供,但多数为市售商品,可以节省时间,并为研究人员提升质控:

  1. 包被缓冲液 - 这种缓冲液可用来稳定某种抗原或抗体,从而促进抗原或抗体被吸收到孔的表面。抗原或包被抗体与塑料孔之间的相互作用会产生吸收和固定。这种被动结合受多种因素影响,包括塑料的表面化学性质、温度、包被缓冲液的 pH 值、抗原/抗体浓度和时间。常用的包被缓冲液包括磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)、碳酸氢钠或类似缓冲液,但应测试和优化这些条件。重要的是,包被缓冲液不应含有会竞争地结合抗原或抗体的蛋白。
  2. 封闭缓冲液 - 这种缓冲液能防止检测抗体非特异性地结合平板表面。这种缓冲液要么含有会封闭结合位点的蛋白,要么含有会防止结合的去垢剂。基于蛋白的封闭缓冲液仅在包被步骤之后才可以添加,因为溶液中的蛋白会被吸附到塑料上所有未结合位点上。像包被分析物或抗体一样,任何洗涤步骤都不会去除这些非特异性蛋白。封闭缓冲液需要优化,才能达到最大灵敏度和最低背景,并且不应含有会干扰检测抗体的组分。
  3. 洗涤缓冲液 - 这些缓冲液在各步骤之间用来去除所有未结合的物质,并需要在使用后完全去除。洗涤次数、每次洗涤的时长以及缓冲液中的去垢剂含量需要进行优化。
  4. 检测缓冲液 - 这些缓冲液含有被抗体-酶复合体催化的所需底物。这些底物多数对缓冲条件具有灵敏性,因此在考虑新的检测化学成份时,必须考虑裂解缓冲液和其他添加物,以减少检测分子出现非特异性裂解。

微孔板

可以用多种微孔板样式进行 ELISA,包括 96 孔微孔测试条、96-、384- 和 1536-孔板。

最常见的平板有平坦孔底,并且由聚苯乙烯制成。平板用多种方式处理,以产生疏水/亲水或特异性反应部分。

例如,使用蛋白 A 来更特异性地结合表面。选择优质平板和表面包被有利于降低背景,并增强结合。

检测化学成份通常会影响平板颜色选择:发色法为透明色,荧光法为黑色,比色法为白色。

ELISA 抗体

为 ELISA 选择的抗体应仔细选择,并验证使用。根据所选抗体能否高度特异性地结合目的抗原,可预测实验是否成功和结果是否可靠。除了特异性,选择的抗体还应对抗原具有较高的亲和力和亲合力。换言之,抗体应结合在一种物种的一个抗原上的表位(特异性),这种结合应快速而有力(亲和力),并且一旦结合,抗体-抗原复合体应稳定(亲合力)。

为夹心检测选择的抗体更复杂,因为每种抗体需要定向一个不同的表位。根据实验需要,夹心检测的 2 种抗体可以来源于不同物种或相同物种。

在 ELISA 中可使用单克隆抗体和多克隆抗体,但两者都能提供某些有利于实验者的优势。

在 ELISA 中使用单克隆抗体或多克隆抗体的优势

单克隆抗体:

  • 对一个表位有特异性,因此它们不会干扰其他抗体结合抗原的其他区域
  • 不太可能非特异性地结合其他抗原
  • 可用于一个 ELISA 的所有步骤
  • 作为非竞争性抗体匹配对的一部分,对夹心 ELISA 尤其有用

多克隆抗体:

  • 可检测同一抗原上不同表位的抗体并集
  • 可能会检测一个靶蛋白上的多个结合位点,因此可提供更稳定的信号

对于需要用某种酶(如 HRP 或 AP)标记的抗体,标记效率、批间变化和偶联后的一致性结合都是设计一个高质量实验需要处理的问题。

ELISA 对照

对照对确保每份样品产生的信号在生理学上都是准确的非常重要。可以合并使用一组对照来验证一个 ELISA 实验的有效性。有如下对照:

  1. 空白对照可用来提供背景信号参考,并确保读取值表示样品中的分析物浓度,而不是实验设置的人为结果。
  2. 阳性和阴性对照可用来比较分析物产生的信号。
  3. 加标对照可用来给出有关某种特殊样品基质中分析物发现程度的信息,从而表明检测性能。

微孔读板机

所选择的微孔读板机应匹配 ELISA 中使用的检测类型。比色反应的灵敏度最低,其次是化学发光和荧光反应。使用的检测类型应根据样品分析物数量以及是否需要放大和/或多重分析来决定。重要的是,用特定微孔读板机检测的动态范围和灵敏度应该还会影响检测方法的选择。

如何优化 ELISA 方法

优化一个 ELISA 实验对其成功必不可少。ELISA 是一个多步骤流程,因此在开始一个实验之前,单独检测每个组分。

样品制备

样品制备需要根据起始物质进行优化。含有高浓度抗体的样品在通过 ELISA 分析之前需要额外的处理步骤。据说,这些样品会有“基质效应”,由于与大量蛋白或其分解产物之间有相互作用,这种效应会干扰捕获或检测抗体的正常结合。使用适当的包被、洗涤和封闭缓冲液以及高稀释度的起始样品,即可克服这些效应。

缓冲液(包被、封闭、裂解/结合、洗涤)

如果可能,应使用市售的预验证缓冲液。如果无市售缓冲液,则应按照如下优化缓冲液:

  1. 包被缓冲液应保留所有蛋白的生物活性和稳定性,尤其是结合的分析物,不得干扰其与塑料的被动结合,或改变他们的表位。
  2. 封闭缓冲液应包含浓度适当的非离子去垢剂和/或非特异性蛋白,以结合包被平板上的开放位点。
  3. 样品应放在裂解缓冲液(如果使用细胞)或配制的结合缓冲液中。需谨慎操作,以便裂解缓冲液的组分不会干扰抗原/抗体结合,但仍能裂解细胞。
  4. 洗涤缓冲液应含有适量的盐和去垢剂,并且 pH 值 应适当,以稳定抗体-抗原复合体,同时降低背景噪音。

微孔板

各孔之间的一致性对于确保一个 ELISA 的准确性和可重复性是必不可少的。这包括正确选择平板,准确移液,维持温度、湿度和 pH 值。对于平板包被,最佳的包被条件和平板-结合能力根据每种蛋白有所变化,并应根据实验决定。

抗体

ELISA 高度取决于抗体选择,因此对于在捕获和直接/间接检测中使用的任何抗体,应评估其特异性、亲和力和亲合力,并应根据经验检测和优化。

适当的抗体浓度滴定是至关重要的。梯度稀释的捕获和检测抗体应谨慎制备。产生的信号应与适当的对照进行比较,以发现实验中的任何人为结果,并确定动态检测范围。理想浓度可产生最强的信号和最低的噪音。

此外,抗体类型也应谨慎选择。例如,对于夹心 ELISA,如果使用单克隆抗体,那么必须针对不同表位产生这些抗体,才不会在彼此之间产生竞争。根据样品类型(即同质性或异质性)和预计的分析物浓度,应明确选择多克隆抗体与单克隆抗体。随后在用于某个 ELISA 之前,应根据实验确认和验证这种选择。

ELISA 结果

ELISA 结果分为 3 大类:定量、半定量和定性。

定量 ELISA 需要使用标准品,以解释实验样品的结果。生成标准曲线(通常借助梯度稀释且浓度已知的某种分析物或其他标准品)。将样品的读取值与标准曲线进行比较,并确定绝对定量的分析物浓度。

如果认为某个 ELISA相对定量或半定量,则应互相比较实验样品的读取值,或与参照样品进行比较,并且分析物的浓度以这些其他样品的相对浓度表示。

与空白孔或无关对照相比,使用信号的存在来决定某种分析物是否只存在或不存在于样品中时,便是定性 ELISA。

如何解释 ELISA 结果

通常,每个 ELISA 孔的读取值为一个数值。ELISA 结果显示为与分析物浓度对数相对的相对光单位 (RLU) 或相对荧光单位 (RFU) 测量值。

为了测定每个孔中分析物的绝对浓度,需要使用对已知数量的抗原进行梯度稀释构建的标准曲线。接下来,将在每份实验样品中检测到的信号测量值与标准曲线进行比较,即可得到分析物的浓度。对于这类分析,需要会产生高敏实验的实验设计。

如果不需要绝对定量,则互相比较样品或与某种对照样品比较,以进行相对定量。例如,HIV 感染后产生的血清抗体样品可以与基础血清抗体样品进行比较,并且两个测量值的比值就指示 HIV 诱发抗体数量的倍数变化。

最后,如果不需要进行定量分析,则与某种空白样品或阴性对照相比存在任何信号就指示存在分析物。这是最不精确的分析类型。

在进行 ELISA 检测时最常见的问题

孔与孔之间或每次检测之间的变化大、没有信号、信号弱以及高背景均是一个 ELISA 中频繁遇到的问题。上述优化步骤有助于排解这些问题。

ELISA 7179 PathScan 夹心 ELISA 试剂盒

PathScan® Total 4E-BP1 Sandwich ELISA Kit #7179: 氨基酸 (AA)/未经处理的和已经 AA/胰岛素处理的 HEK-293T 细胞裂解物蛋白浓度与在 450 nm 处的吸光度之间的关系如图所示。

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