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染色质免疫沉淀法 (ChIP) 概述

1. 什么是 ChIP?

染色质免疫沉淀法 (ChIP) 是一种基于抗体的技术,可用来选择性地使特异性 DNA 结合蛋白及其 DNA 靶标富集。ChIP 可用来研究某种特殊的蛋白-DNA 相互作用、多种蛋白-DNA 相互作用或全基因组或部分基因内的相互作用。

ChIP 使用可选择性地检测和结合蛋白的抗体,包括组蛋白、组蛋白修饰、转录因子、辅因子,以提供有关染色质状态和基因转录的信息。在 ChIP 中结合使用蛋白质组分析和分子生物学技术,能够让研究者理解目的细胞或组织中的基因表达和调节。

2. 何时使用 ChIP?

通常,ChIP 用来检测某种特异蛋白或某种特异蛋白修饰在某个基因组区域的相对丰度。ChIP 可以用来回答大量涉及蛋白和染色质相互作用的科学问题。例如,ChIP 可用来比较某些蛋白在各位点上的存在情况,绘制某个目的基因组区域内的各种蛋白图,或定量能够在受到刺激一段时间后结合诱导基因的蛋白。

3. ChIP 是如何工作的?

ChIP 背后的原理相对较为直接,并依赖于使用一种抗体从细胞或组织提取物蛋白混合物中分离某种蛋白、组蛋白、转录因子或辅因子及其结合的染色质,或使之沉淀。因此,这种技术的名称为:染色质免疫沉淀法。在 ChIP-PCR 或 ChIP-seq 中,使用广泛提供的 PCR 或 qPCR 试剂和下一代测序 (NGS) 技术便能检测和定量免疫富集的 DNA 片段。

4. 天然 ChIP (N-ChIP) 与交联 ChIP (X-ChIP) 分别是什么?

根据实验问题和实验起始材料,可以进行 2 种 ChIP 技术:1) 天然 ChIP (N-ChIP) 和 2) 交联 ChIP (X-ChIP)。两种 ChIP 均有自己的优点和缺点:

  1. 在 N-ChIP 中,不使用固定剂来使蛋白和染色质交联。相反,从用核酸酶消化的胞核中分离出天然染色质。抗体针对未固定的抗原产生,因此 N-ChIP 的优势在于抗体能更好地检测和结合其靶标抗原。因组蛋白丰度较高,PCR 可能不是下游分析所必需的。虽然这些优势使得 N-ChIP 成为一种颇具吸引力的方法,但它只能用来检测组蛋白。此外,在染色质消化和免疫沉淀步骤期间,蛋白结合丢失可能会使数据出现偏差,或妨碍适当分析。
  2. 在 X-ChIP 中,使用甲醛等化学固定剂来使目的蛋白和 DNA 交联,并通过声处理或核酸酶消化来进行染色质碎裂。X-ChIP 的优势在于它适用于组蛋白和不是组蛋白的蛋白,并且通常需要的细胞起始材料少于 N-ChIP。X-ChIP 还能在提取期间最大程度减少染色质蛋白丢失的机会,以便检测瞬时蛋白相互作用。沉淀步骤不那么高效,但通过 PCR 达到的 DNA 扩增是下游分析所必需的。

5. 有哪些不同类型的 ChIP 实验?

一旦完成染色质免疫沉淀,便可对纯化的染色质及有关蛋白、组蛋白、转录因子和辅因子进行多种下游分析。最常见的单基因分析和全基因组分析方法分别是 qPCR 和 ChIP-seq。PCR 和 ChIP-芯片也是下游分析的选择。

5.1 ChIP-PCR 有哪些优点?

ChIP-PCR 可用来分析基因组中一部分已知靶标位点上的组蛋白修饰和/或蛋白结合情况。在 ChIP-PCR 中,使用广泛提供的 PCR 或 qPCR 试剂和技术可检测和定量免疫富集的 DNA 片段。使用 ChIP-qPCR 可以对多种样品中的特定基因组区域进行快速和定量比较。这比全基因组测序方法更便宜,更省时。

5.2 ChIP-芯片有哪些优点?

ChIP-芯片技术是指使用一个 DNA 微阵列芯片来分析经 ChIP 免疫富集的 DNA 片段。使用基因组覆瓦式微阵列技术可以对结合分离 DNA 的蛋白进行全基因组分析,并产生一个高分辨率的有关蛋白结合和蛋白修饰的基因组图。ChIP-芯片在基础研究和疾病研究中有多种用途。例如,可用来检测转录因子、增强子和阻遏蛋白的结合位点,并比较对照和病理性样品中的这些结合蛋白种类。但 NGS 的成本大幅下降,并且使用 ChIP-seq 也能获得类似结果,因此更多的人会选择进行 ChIP-seq,而不是 ChIP-芯片。

5.3 ChIP-seq 有哪些优点?

与 ChIP-芯片类似,ChIP-seq 提供有关全基因组蛋白结合的信息。但不像 ChIP-芯片,ChIP-seq 使用 NGS 技术来检测 DNA 片段,并根据整个基因组将其绘制成图。

有了更现代的 DNA 扩增技术,可以在数日之内对少量输入 DNA 进行稳健分析。当起始材料较稀有时,在库制备方法方面取得的这些技术性进展会使 ChIP-seq 实验成为可能。

此外,有了使用短序列(称为条形码)独特地标记 DNA 样品的新技术,现在可以将个别片段汇集到一个测序泳道中,以便进行多重分析。这大大提升了 DNA 测序实验的效率,并降低了成本,从而进一步支持 ChIP-seq 应用。

合起来,由于 DNA 测序技术方面的进展,ChIP-seq 的优势在于可以在相对较短的时间内,便宜地对大量经 ChIP 富集的 DNA 样品进行测序,同时敏感性和准确性均高于 ChIP-芯片。

6. ChIP 实验中有哪些不同的步骤?

ChIP 实验要遵循常规实验步骤:

  1. 蛋白-DNA 交联仅针对 X-ChIP
  2. 细胞裂解
  3. 通过消化(针对 X-ChIP 和 N-ChIP)或声处理剪切(仅针对 X-ChIP)来进行染色质碎裂
  4. 使用特异性抗体进行免疫沉淀
  5. 清除 DNA 以进行下游分析
  6. 通过 PCR、qPCR、微阵列或 NGS 进行 DNA 分析

重要的是,在决定一个 ChIP 实验是否成功时,每个步骤中的阳性和阴性对照是不可或缺的。

ChIP 实验步骤

一个 ChIP 实验步骤中最关键步骤的概述。

 

6.1 ChIP 实验如何交联细胞和组织?

使用交联试剂来将蛋白“固定”到它们结合的 DNA 上。以甲醛为基础的试剂通常用来进行这种固定。细胞和组织通常以类似的方式固定,但组织需要更长的固定时间,并且固定的速度更快,以便在靶组织开始变性之前使之快速渗透。

除了抑制抗体结合其蛋白靶标,过度固定染色质会降低声处理碎裂的效率。因此,固定时间应根据经验决定,以便最大程度让抗体结合抗原,同时又能使蛋白最佳地交联其靶标 DNA。

声处理时程

小鼠心脏 (H)、脑 (B) 和肝脏 (L) 细胞需交联 10 分钟或 30 分钟,如图(左小图)所示。染色质制备后声处理 4 分钟。使用 SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383 中的指定抗体对用心脏组织制备的染色质进行 ChIP,富集的 DNA 通过使用指定基因引物进行实时 PCR 来进行定量(右小图)。每份样品中的免疫沉淀 DNA 量表示为标准化信号与阴性位点 GAPDH 的比值(等于 1)。

 

6.2 如何碎裂染色质?

染色质碎裂是成功进行一次 ChIP 实验所必需的。染色质碎裂是使染色质可溶并允许其沉淀所必需的。此外,ChIP 实验的分辨率取决于染色质碎裂,因为 DNA 片段大小决定 ChIP 实验的分辨率。

酶消化使用微球菌核酸酶 (MNase),MNase 会剪切核小体之间的双链 DNA,从而产生染色质片段。彻底的 MNase 消化会产生含 150 个碱基对的 DNA 片段(单核小体),不彻底的消化也能产生含 150 - 750 个碱基对的 DNA 片段(单核小体、双核小体和三核小体)。声处理使用机械力来碎裂染色质。声处理会碎裂核小体之间和之内的染色质,从而产生 150 - 1000 个碱基对的许多染色质片段。

对于 X-ChIP,使用酶消化或声处理来剪切染色质。声处理 ChIP 实验步骤中的声处理条件应根据经验决定,因为它们根据细胞类型和实验条件有所不同。消化条件在不同细胞类型和组织之间更一致,但染色质片段大小仍应在免疫沉淀之前进行分析。

对于 N-ChIP,使用核酸酶来碎裂染色质,以便在未固定的样品中维持蛋白结合。核酸酶碎裂也应根据经验决定,以便最大程度减少染色质过度消化。

6.3 为什么要在 ChIP 中使用酶消化?

在 N-ChIP 中必须要使用核酸酶消化,因为蛋白不交联 DNA,并且与声处理碎裂有关的苛刻条件会导致染色质蛋白与 DNA 解离。ChIP 非常适合用来分析组蛋白-DNA 相互作用,因为组蛋白-DNA 结合非常牢固稳定。但 N-ChIP 不适合用来分析转录因子和辅因子-染色质结合。

在 X-ChIP 中,使用酶消化或声处理来碎裂染色质。酶消化的优势包括碎裂一致,碎裂条件温和(低热和去垢剂少),这能更好地保留染色质和抗体表位的完整性,从而使结合转录因子和辅因子的染色质出现免疫富集增强。

6.4 为什么在 ChIP 中使用超声处理来碎裂染色质?

不像通过酶消化进行的染色质碎裂,声处理依靠机械力来将染色质碎裂成更小的片段。免疫富集的最佳染色质片段大小介于 200 个至 1000 个碱基对之间。声处理是一种用来碎裂染色质的传统方法,可使用传统的探头式超声仪或声处理更集中的高级水浴超声仪来进行。声处理能产生真正随机的染色质片段,但需要广泛优化不同细胞系和组织,并且难以在实验之间做到重复。需要较多的去垢剂缓冲液,并能在声处理期间产生热,这都会有损染色质蛋白上的染色质和抗体表位的完整性。

6.5 优化 ChIP 中的染色质声处理

传统上,基于声处理的染色质碎裂使用较多的去垢剂缓冲液,并产生热,这都会有损染色质和抗体表位的完整性。因此,对于不同细胞系和组织,用来碎裂染色质的声处理量必须根据经验决定。必须明确和使用产生 150-1000 个碱基对的 DNA 片段的最低声处理量,以便最大程度减少染色质损伤。

在通过 qPCR、DNA 芯片或 NGS 进行完整的 ChIP 实验下游分析之前,应使用凝胶电泳法来分析经多次声处理的染色质样品。片段大小决定声处理时间,同时也会随声处理时间延长而减小。但数据表明,更长的声处理时间并不会产生更好的结果。因此,要确定获得所需 DNA 大小并避免不必要的染色质损伤所需要的最低声处理量,在凝胶上处理纯化的免疫沉淀 DNA 并确定最理想的片段大小是一种直接的方法。

酶消化

酶消化的染色质在琼脂糖凝胶上进行处理。泳道 1 显示消化不足的染色质。泳道 2 显示消化适当的染色质,而泳道 3 则显示过度消化的染色质。

 

6.6 你如何为 ChIP 选择抗体?

选择一种合适的抗体是成功进行 ChIP 实验不可或缺的。在 ChIP 实验中使用的抗体应对目的蛋白具有特异性,并对抗原具有较高的亲和力。ChIP 或 ChIP-seq 实验的最佳抗体是经 ChIP 或 ChIP-seq 验证的抗体。如果没有针对目的基因的经 ChIP 验证的抗体,那么次一点的选择是经免疫沉淀验证的抗体。要注意的是,并不是所有经免疫沉淀的抗体都在 ChIP 中有效,也并非所有经 ChIP 验证的抗体都在 ChIP-seq 中有效。此外,抗体在蛋白印迹、免疫沉淀、免疫荧光、流式细胞术和 IHC 等其他应用中验证的程度越高,研究者对抗体性能和特异性就越有信心。在验证抗体之后,必须根据经验决定最佳抗体浓度,以及免疫沉淀洗涤条件。

使用 SimpleChIP® 滴定 Ezh2 (D2C9) XP® 兔单克隆抗体 #5246。

使用 SimpleChIP® 酶解染色质免疫沉淀试剂盒 #9005 对用 4 x 106 个 NCCIT 细胞制备的交联染色质滴定 Ezh2 (D2C9) XP® 兔单克隆抗体 #5246。

 

6.7 如何进行免疫沉淀

使用抗体来捕获目的蛋白及其结合的 DNA。抗体浓度应根据经验决定,一般起始点为每 10 μg 染色质 DNA(相当于约 4 x 106 个细胞)使用 0.5-2.0 μg 抗体。缓冲液和洗涤次数的严格程度也应根据经验确定,因为它们会决定抗体对其靶标抗原的亲和力。通常,抗体-染色质孵育要 2 小时至过夜才能完成。

抗体-抗原 (+DNA) 复合体在抗体结合树脂上根据亲和力进行捕获。在 ChIP 实验中,这种树脂通常包含偶联蛋白 A 和/或蛋白 B 的 ChIP 级磁性、球状琼脂糖或琼脂糖珠子。抗体结合蛋白 A 和/或蛋白 G 珠子的亲和力不同,具体取决于产生抗体的物种以及其重链的 IgG 亚型。珠子通常用抗体-染色质孵育 2-4 小时。

需要洗涤步骤来去除不结合抗体的染色质,随后解除交联(针对 X-ChIP)并进行 DNA 纯化。此外,必须进行 IgG 对照免疫沉淀,以确定背景(信噪比)。还必须加入阳性对照抗体(即总组蛋白 H3)和/或阳性对照 qPCR 引物(针对已知的阳性和阴性靶蛋白结合位点),以确定非特异性结合。为获得最佳结果,必须通过 qPCR 对染色质免疫沉淀进行质控,之后再进行下游 NGS 分析。

6.8 如何洗脱蛋白 A/G 珠子上的染色质

使用去垢剂和热来洗脱蛋白 A/G 珠子上的染色质。低速“涡旋”或混合是保持珠子悬浮并加强染色质洗脱所必需的。

6.9 如何解开染色质交联

通过高热和高盐(均是重要的要素)解开交联。此外,还添加蛋白酶 K 来消化有关的染色质蛋白和添加的抗体,以便更高效地进行下游 DNA 纯化。

6.10 如何纯化 DNA

去除染色质交联之后,使用典型的酚-氯仿及随后的乙醇沉淀方法或使用 DNA 纯化柱试剂盒来进行 DNA 纯化。

7. 如何分析富集的 DNA

一旦完成了 DNA 纯化,便可进行多种下游分析,包括 ChIP-PCR、ChIP-qPCR、ChIP-芯片和 ChIP-seq。

7.1 ChIP-PCR 和 ChIP-qPCR 分析

ChIP-PCR 和 ChIP-qPCR 分析最适合单基因分析,并且可用来以一种快速合算的方式对特定 DNA 片段进行扩增和定量。

7.2 ChIP-芯片分析

ChIP-芯片分析使用覆瓦式 DNA 微阵列芯片,绘制一个高分辨率的、有关蛋白结合和蛋白修饰的全基因组图。

7.3 ChIP-seq 分析

ChIP-seq 分析使用标准 NGS 技术来将纯化的 DNA 与之前带注释的全基因组匹配在一起,以检测全基因组蛋白结合分布。  

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