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优化酶联免疫吸附剂测定法 (ELISA) 检测

如何最好地设计一次 ELISA 检测

ELISA 检测的设计和开发取决于各种组分,包括捕获抗体、检测抗体、封闭缓冲液、稀释剂和样品浓度,这只是其中一些例子而已。研究人员必须首先选择他们想使用的 ELISA 形式,然后制定实验步骤。系统地调整和测试各种组分对获得可靠的 ELISA 结果至关重要。

CST 在内部开发、生产并彻底验证 ELISA 产品,以确保最高可能的产品质量和支持。CST 缓冲液经优化可与其他试剂盒组分以及任何 CST ELISA 抗体对一同使用,而且它们可单独出售或以试剂盒形式出售。

Pathscan®FastScan™ ELISA 试剂盒可用于广泛地选择测量重要细胞信号转导节点和其他靶蛋白(包括磷酸化形式)的各种抗体测定法。FastScan™ ELISA 试剂盒包括一个单次洗涤检测实验步骤,可减少实际操作时间和检测复杂性,并让您能够在短短 90 分钟内检测靶标。

虽然 CST 为研究人员提供了广泛的经验证和优化的 ELISA 试剂盒系列,但在设计您自己的 ELISA 时仍需考虑很多注意事项。

如何选择合适的抗体

抗体对的选择对 ELISA 很关键,因此,应评估其特异性和灵敏度。

在单克隆或多克隆之间进行选择时需要考虑以下几点:

  • 单克隆抗体显示出最高程度的特异性,因为它们对单个表位具有特异性,因此不太可能会非特异性地结合其他抗原。它们是克隆形式,因此不会有与这些抗体相关的供应问题。
  • 多克隆抗体能产生更强的信号,因为它们能够结合多个表位。但可能存在供货问题,因此,对于更大的项目,建议检查是否可用。多克隆抗体的反应性可随着时间的推移而改变,因此,长期标准化很重要。

CST 提供完整的经验证的抗体对目录,可确保最佳 ELISA 结果。

确定一次 ELISA 检测的最佳抗体浓度

对捕获和检测抗体进行梯度稀释来适当地滴定抗体浓度。这些与适当的对照进行比较,以确定检测的动态范围以及是否存在任何假象。理想的浓度将为检测提供最高的信噪比和最大的检测线性范围。

增强背景信号

为在 ELISA 检测中减少背景噪音或增强信号,应考虑许多因素:

  • 所需检测灵敏度
  • 抗体特异性
  • 检测方式

此外,可能需要优化:

  • 孵育时间和温度
  • 封闭缓冲液
  • 洗涤步骤,例如洗涤次数

如何为 ELISA 检测选择合适的缓冲液

为了对孔间一致性产生最佳影响并使信号高于背景噪音,应考虑以下因素:

  • 包被缓冲液 - 用于保留所有蛋白的生物活性和稳定性;但该缓冲液不得改变表位或干扰结合。
  • 封闭缓冲液 - 应优化该缓冲液中非离子去垢剂和/或非特异性蛋白的浓度,以结合包被平板上的开放位点。
  • 洗涤缓冲液 - 适量的盐和去垢剂应有最佳 pH,以降低背景噪音并使抗体-抗原复合体稳定。
  • 裂解/结合缓冲液 - 裂解缓冲液应进行优化,以便在不干扰抗原/抗体结合的情况下裂解细胞。

孔间一致性的重要性

为获得可靠的结果,应对 ELISA 检测中所有的孔考虑相同的注意事项。为进一步避免孔间可变性,应准确且始终如一地进行样品移液和洗涤。使用多通道或自动移液和洗涤系统可改善结果。此外,还应注意孔板条件,包括温度和湿度。

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