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细胞衰老

什么是衰老?

细胞衰老是指稳定细胞周期停滞的状态,在这种状态下增殖细胞会对促生长刺激产生耐受,通常由 DNA 损伤所引起。Leonard Hayflick 首先描述了细胞衰老,他观察到人类胎儿成纤维细胞最终会停止分裂,但在长时间培养后仍然具有活力和代谢活性。现在普遍认为,除了具有干细胞样特性的细胞类型外,只有转化的恶性细胞会无限复制,而非转化细胞则不会。除了在体外受控条件下发育的胚胎干细胞或诱导多能干细胞,此类细胞还包括内源性生殖干细胞和成体干细胞。衰老细胞与静息细胞和终末分化细胞均不同,其中静息细胞能够重新进入细胞周期。

衰老细胞的特征是形态学和代谢变化、染色质重构、基因表达改变以及出现一种称为衰老相关分泌表型 (SASP) 的促炎症表型。衰老的生物学作用复杂,衰老细胞的保护作用和有害作用均已有描述,主要取决于生理环境。例如,尽管衰老可能作为避免受损细胞恶性转化的机制进化而来,但衰老的发生可能会导致许多年龄相关病变,包括癌症、组织退化和炎症性疾病。

老化和细胞衰老这两个术语不能互换使用。老化是随时间推移的进行性衰退,而衰老在整个生命周期中都可发生,包括胚胎发生期间。衰老细胞的数量随着年龄增大而增加,但衰老还在发育以及伤口愈合中发挥重要作用。

β-半乳糖苷酶染色

β-半乳糖苷酶染色可检测 pH 依赖性 β-半乳糖苷酶活性的表达(细胞染成蓝色),这是衰老细胞的已知特征。正常细胞(左图);衰老细胞(右图)。

 

为何会发生衰老?

衰老能够阻止含有受损 DNA 的细胞复制,这是一种重要的抗肿瘤功能。衰老通常由损伤性刺激引起,包括端粒缩短(复制衰老)、DNA 损伤(DNA 损伤诱导衰老)和致癌信号转导(癌基因诱导衰老)。

了解复制衰老和海弗利克极限

复制衰老是指正常非恶性细胞在大约 50 次分裂(称为海弗利克极限)后会停止体外分裂。复制衰老由端粒缩短所诱导。在每一轮的 DNA 复制中,端粒都会逐渐缩短,最终达到一个临界长度,阻止进一步复制,从而停止细胞分裂。较短的无帽端粒会引起 DNA 损伤应答,从而触发衰老。

DNA 损伤诱导衰老

DNA 损伤会触发 DNA 修复机制、凋亡或衰老,具体取决于损伤程度和生理环境。衰老细胞的特征是持续的 DNA 损伤应答 (DDR),包括慢性 ATM(共济失调性毛细血管扩张突变)和 ATR(共济失调性毛细血管扩张和 Rad3 相关)激酶信号转导,最终通过激活 p53/p21 和 p16/pRb 通路诱导细胞周期停滞和衰老。 持续的 DNA 损伤和后续衰老还可通过电离辐射、化疗、遗传毒性应激和氧化应激所诱导。

细胞周期 G2/M DNA 损伤信号转导
 

癌基因诱导的衰老

细胞衰老可由致癌信号转导所诱导,作为一种强效的细胞自主抗癌机制。在出现致癌信号转导的细胞中发生的衰老,是一种防止其转化为恶性细胞的应答。癌基因诱导衰老 (OIS) 来源于 H-Ras 等癌基因的的过度激活或 PTEN 等肿瘤抑制基因的失活。例如,H-RASV12 是 GTP 酶 H-RAS 的致癌形式,它的表达可通过诱导慢性 p38 丝裂原活化蛋白激酶 (p38 MAPK) 信号转导触发 OIS。强烈的有丝分裂信号转导也可以通过复制应激诱导 DNA 损伤,从而触发停滞复制叉的崩解。

衰老的生物标志物

磷酸化组蛋白 H2A.X IF

磷酸化组蛋白 H2A.X (Ser139) 也称为 γ-H2A.X,是细胞衰老的常用标志物(右侧图像中绿色染色的胞核)。

 

衰老细胞的特征是稳定细胞周期停滞、形态学和代谢变化、染色质重构、基因表达改变以及出现老化相关分泌表型 (SASP)。需要注意的是,并非所有衰老细胞都表现出所有的衰老生物标志物。此外,衰老生物标志物不一定为衰老细胞所特有,例如某些标志物也可在凋亡细胞或休眠细胞中观察到。因此,衰老细胞的鉴别有赖于对多种生物标志物的观察,如以下所述:

稳定的细胞周期停滞

只有具有稳定细胞周期停滞的细胞才被视为衰老。与休眠细胞不同,衰老细胞不会因任何已知生理刺激而重新进入细胞周期。细胞周期停滞由 p53/p21CIP1 和 p16INK4A/pRb 肿瘤抑制基因通路所介导,详述如下。在衰老细胞中经常观察到 p16INK4A 的表达,这是一种有用的生物标志物。但 p16INK4A 也在 pRb 阴性肿瘤和细胞系中高度表达。

形态学和代谢变化

与分裂细胞相比,衰老细胞通常增大并呈扁平形状。衰老细胞出现广泛空泡化,有时为多核。此外,由于 lamin B1 表达丧失,可观察到核膜完整性破坏。衰老细胞积累功能失调的线粒体,并表现出活性氧 (ROS) 水平升高。还可观察到溶酶体内容物增加和溶酶体活性改变,表现为 pH 为 6.0 时 β-半乳糖苷酶活性增加 ,使其成为广泛采用的细胞衰老生物标志物。

Lamin B1 IF

Lamin B1(此处显示为绿色)丢失是细胞衰老的标志物。

 

染色质重构和基因表达改变

衰老细胞的标志特征是广泛的染色质重构,最显著的是衰老相关异染色质簇集 (SAHF) 的形成。这些兼性异染色质位点在促增殖基因沉默中发挥作用,包括 E2F 靶标基因如周期素 A。衰老细胞通常包含 30-50 SAHF,其特征为 DAPI 亮染以及 macroH2A、异染色质蛋白 1 (HP1) 和赖氨酸 9 二甲基化或三甲基化组蛋白 H3 (H3K9Me2/3) 免疫反应性。尽管 SAHF 在衰老时经常观察到,但一些细胞出现衰老时并不形成 SAHF。

HP1 IHC

HP1 是一种常用的细胞衰老标志物。使用 HP1 alpha 抗体对石蜡包埋人乳腺癌细胞中的 HP1 表达进行免疫组织化学分析。

 

DNA 损伤和持续的 DNA 损伤应答 (DDR)

DNA 损伤(例如 DNA 双链断裂)是衰老的重要特征。衰老细胞表现出持续的 DNA 损伤应答 (DDR),最终触发细胞周期停滞。衰老细胞含有一种胞核损伤灶,称为具有增强衰老的染色质改变的 DNA 片段 (DNA-SCARS),与 PML 核小体相关,并导致激活的 p53、ATR 和 ATM 等 DDR 蛋白积累。发生于去帽端粒的 DNA-SCARS 被称为端粒功能障碍诱导的损伤灶 (TIF)。DNA 损伤的另一个指标是 γ-H2A.X,这是 H2A.X 的磷酸化形式,是双链 DNA 断裂后检查点介导的细胞周期停滞和 DNA 修复所需的变异体组蛋白。电离辐射、紫外线或拟辐射剂引起的 DNA 损伤会导致 H2A.X 在 Ser139 位点的快速磷酸化。

磷酸化组蛋白 H2A.X IF

H2A.X 是一种常用的细胞衰老标志物。使用 Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Mouse mAb(绿色)对未经处理的(左图)或经紫外线 (100 mJ/cm2) 处理(右图)的 HeLa 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白微丝用 DyLight™ 554 Phalloidin(红色)标记。

 

衰老相关分泌表型 (SASP)

许多衰老细胞会出现一种促炎症的衰老相关分泌表型 (SASP),可介导非细胞自主的衰老效应,包括有益和有害的效应。SASP 由分泌的细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶的高度复杂混合物组成,其确切成分随细胞和组织环境以及诱导衰老的刺激而显著不同。这些分泌因子促进与相邻细胞和免疫系统的通信,最终影响衰老细胞的命运。例如,SASP 将免疫细胞募集至衰老细胞,从而促进其清除,发挥肿瘤抑制功能。然而矛盾的是,已表明 SASP 可通过分泌促进血管生成、细胞外基质重塑或上皮-间质转化 (EMT) 的因子来促进肿瘤细胞发展。此外,衰老诱导的慢性炎症可引起系统性免疫抑制,可能导致包括癌症在内的疾病发生。这种慢性炎症还可能导致衰老相关的组织损伤和变性。

衰老信号转导通路

衰老的触发因素最终会聚于诱导细胞周期停滞的 p53/p21CIP1 和 p16INK4A/pRb 肿瘤抑制基因通路。

细胞周期停滞

稳定的细胞周期停滞是衰老的一个定义性特征,由端粒缩短、致癌信号转导和 DNA 损伤所诱导。细胞周期停滞通过 p53/p21CIP1 或 p16INK4A/磷酸化-Rb 肿瘤抑制基因通路的激活所介导。有趣的是,在不同类型的癌症中常发现通路组分中的突变。

细胞周期 G2/M DNA 损伤信号转导

细胞周期 G2/M DNA 损伤信号转导

慢性基因组应激或端粒损耗导致的持续 DNA 损伤应答 (DDR) 造成肿瘤抑制基因 p53 激活,进而激活 p21CIP1 从而启动细胞周期停滞。p53 的上游是激酶 ATR 和 ATM,它们分别通过 Chk1 和 Chk2 激活 p53,作为 DDR 的一部分。一旦 p21CIP1 被 p53 激活,则抑制周期素依赖性激酶 (CDK),CDK 可阻止细胞周期进展通过 G1 期至 S 期的检查点。此外,CDK 抑制可阻断成视网膜细胞瘤抑制蛋白 (Rb) 的磷酸化,从而阻止 E2F 介导的促增殖基因转录。磷酸化 Rb 的抑制还可通过 p16INK4A 的激活直接介导,这可阻止 CDK4 和 CDK6 介导的 Rb 磷酸化以及下游 E2F 介导的转录。

细胞衰老的转录调节

细胞衰老的转录调节

 

衰老中最常见的蛋白

Cell Signaling Technologies 提供了用于鉴别衰老细胞的抗体和检测试剂:

蛋白质或标志物 在衰老中的作用
衰老相关 β-半乳糖苷酶 当衰老细胞中 pH 为 6.0 时活性增加
p53 其激活触发细胞周期停滞
Rb(成视网膜细胞瘤抑制蛋白) 其抑制触发细胞周期停滞
p21CIP1 抑制周期素依赖性激酶;位于 p53 下游
p16INK4A 抑制 pRb 磷酸化和失活
Bcl-2 增加衰老细胞表达,抑制凋亡
macroH2A1.1 macroH2A1 亚型;SAHF 标志物
macroH2A1.2 macroH2A1 亚型;SAHF 标志物
H3K9Me2/3(赖氨酸9 二甲基化或三甲基化组蛋白 H3) SAHF 标志物
HP1(异染色质蛋白 1) SAHF 标志物
磷酸化组蛋白H2A.X (Ser139) DNA 损伤标志物
Lamin B1 在衰老细胞中表达降低可导致核膜破坏
HMGB1(高迁移率族蛋白 B1) SASP 组件
IL-6(白介素 6) SASP 组件
TNF-α(肿瘤坏死因子 α) SASP 组件
MMP3(基质金属蛋白酶-3) SASP 组件

端粒及其在衰老中的作用

在大部分体细胞中,端粒缩短会触发复制衰老,这与不表达端粒的转化细胞不同。

端粒和端粒酶的简要说明

端粒是染色体末端的重复核苷酸序列及其相关的蛋白质,作为防止染色体降解和末端融合的保护帽。端粒包含数百到数千个富含 GT 的短串联重复序列,然后是富含 GT 的单链突出。构成 shelterin 复合体的端粒结合蛋白与重复序列结合,形成 T 形环结构,为染色体末端加帽。Shelterin 复合体由端粒重复因子 1 (TRF1)、端粒重复因子 2 (TRF2)端粒重复结合因子 2-相互作用蛋白(TERF2IP,也称为 RAP1)、端粒保护蛋白 1 (POT1)、TRF1- 和 TRF2-相互作用核蛋白 2 (TIN2) 以及 TIN2 结合蛋白 TPP1 组成。

TPP1 已知和预计的蛋白间相互作用。

TPP1 已知和预计的蛋白间相互作用。

 

DNA 聚合酶无法完全复制端粒序列,这会导致大多数体细胞中端粒会逐渐截短。转化细胞、干细胞以及生殖细胞表达端粒酶,这是一种可从头合成端粒末端序列的核糖核蛋白复合体。端粒酶复合体由端粒酶逆转录酶 (TERT)、端粒酶 RNA (TERC) 和 dyskerin (DKC1) 组成。由于在表达端粒酶的细胞中端粒长度得以维持,因此它们能够持续增殖,而不会出现复制衰老。

衰老中的端粒调控异常

调控端粒稳定性或长度的机制破坏(例如形成 shelterin 或端粒复合体的蛋白突变)与基因组不稳定、组织损伤和癌症有关。与端粒维护机制缺陷相关的遗传疾病统称为端粒病。例如,编码 TERT、TERC、DKC1 或 TINF2 的基因突变会导致先天性角化不良 (DKC),这种疾病特征为指甲营养不良、皮肤色素沉着过度和口腔内白色斑块(口腔白斑病)。DKC 患者经常发生骨髓功能障碍,并且患白血病及其他癌症的风险更高。Hoyeraal-Hreidersson 综合征是一种更严重的 DKC,可导致小脑萎缩和小头畸形。端粒功能障碍还与特发性肺纤维化、家族性肝硬化和自发性急性髓系白血病 (AML) 相关。

端粒长度及其对衰老的影响

在每一轮 DNA复制中,端粒会逐渐缩短 50-100 碱基对,从而导致复制衰老。在 DNA 合成期间,DNA 聚合酶无法完全复制后随链上的末端序列,称为“末端复制问题”。因此,这些未复制的序列被截短,导致进展性端粒损耗。一旦端粒达到临界长度,具有保护作用的端粒帽状结构被破坏,并被细胞识别为 DNA 双链断裂,从而触发持续的 DNA 损伤应答并停止进一步细胞分裂。表达端粒酶的细胞如癌细胞能够维持端粒长度,从而避免衰老。

衰老研究为何重要?

衰老细胞随年龄积累,导致正常的老化过程以及年龄相关疾病。衰老、老化和年龄相关病变(包括癌症、神经退行性变以及代谢和心血管疾病)之间的联系在很大程度上推动了衰老研究领域的进展。对啮齿类动物模型的研究显示,在体内选择性清除衰老细胞可减少炎症,增强免疫系统功能,从而延迟年龄相关疾病的进展,增强健康和延长寿命。例如,诱导衰老的药物(包括某些化疗药物)可通过抑制复制潜力而对癌症有效。但是,接受化疗患者中的衰老细胞累积(原因可能是 DNA 损伤),被认为可导致不良副作用,尤其是疲劳。此外,衰老细胞还可以通过释放 SASP 组分促进癌症复发和转移。因此,在化疗患者中使用 senolytics(一种针对衰老细胞的靶向治疗药物)有助于预防癌症复发,并缓解某些副作用。Senolytic 疗法还能够在正常小鼠中延长寿命并延迟年龄相关的身体衰退,提示它们或许可以有效治疗年龄相关疾病。目前正在人体临床试验中测试 senolytic 药物用于治疗骨关节炎和慢性肾脏疾病。

衰老研究模型

一类导致过早老化类似疾病(称为早老性综合征)为探索基因组完整性和 DNA 损伤在老化过程中的作用提供了线索。在人类中发生的此类疾病包括 Werner 综合征、Hutchinson-Gilford 早老症和着色性干皮病。早老性综合征小鼠模型已被用于研究过早老化和衰老的机制。例如,表达低水平 BubR1(一种细胞周期检查点激酶)的小鼠表现出加速老化,并在出现年龄相关病变的某些组织中表达高水平的 p16INK4A。敲除生殖系中的 p16INK4A 能够延迟 BubR1 类早老小鼠的老化,这与衰老细胞水平降低相关,证明生物性老化和细胞衰老之间在体内存在功能性关联。此外,在可以选择性清除表达 p16INK4A 的衰老细胞的转基因小鼠模型 INK-ATTAC 中,已表明衰老细胞丧失能够延长小鼠的寿命和健康期。

已开发出多种衰老加速小鼠 (SAM) 模型动物品系。这些品系最初源自具有加速衰老表型(包括活动减少、脱毛和寿命缩短)的小鼠。SAM 小鼠表现出学习和记忆缺陷、骨质疏松症和淋巴瘤等病理生物学表型。

另一方面,动物模型还用于研究延迟老化和衰老。例如,裸鼹鼠是一种大小与小鼠相仿的啮齿类动物,可生存 30 年或以上,大大超出基于其体型预测的寿命。裸鼹鼠很少发生癌症,甚至在老年仍然保持健康和活跃。有趣的是,在这种动物中衰老正常发生,表明长寿并非依赖于消除细胞的衰老应答。

裸鼹鼠

裸鼹鼠

特征:
Roman Klementschitz, Wien [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/)],来自 Wikimedia Commons

 

阐明衰老和老化的机制对于理解和潜在治疗或预防人类的年龄相关疾病具有重要意义。二甲双胍是一种已获批准的糖尿病药物,可降低胰岛素水平并抑制 IGF-1 信号转导,导致 AMPK 激活和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (MTOR) 抑制。二甲双胍能够抑制 SASP,在人体内可降低癌症发生率。二甲双胍靶向衰老 (TAME) 临床研究将测试二甲双胍治疗是否能够延缓或预防年龄相关疾病的发生,例如癌症、心脏病和痴呆。

mTOR 信号转导
 
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