利用 SignalStain^® Boost 检测试剂进行免疫组织化学的实验步骤 - 适用于冰冻切片

*重要事项：请参阅产品网页，以确定某种产品是否经验证以及是否获批用于冷冻组织切片。请参见产品网页，了解合适的抗体稀释度和修复液。

注：请参见产品网页，了解产品特定的实验步骤建议。

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 二甲苯。
2. 乙醇（无水变性，组织学分级 100% 和 95%）。
3. 苏木精（可选）。
4. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS：添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH₂O，然后将其混匀。
5. 固定液选择：请参阅产品数据表，以了解最佳的固定液。
   1. 10% 中性缓冲福尔马林。
   2. 丙酮。
   3. 甲醇。
   4. 3% 甲醛：要制备 100 ml 溶液，将 18.75 ml 16% 的甲醛加入到 81.25 ml 的 1X PBS 中。
6. 10X Tris 盐缓冲液 (TBS) 洗涤缓冲液：(#12498) 要制备 1 L 1X TBS 溶液，将 100 ml 的 10X TBS 加入 900 ml dH₂O 中，并混匀。
7. 甲醇/过氧化物酶：制备方法：将 10 ml 30% H₂O₂ 加入到 90 ml 甲醇中。储存于 -20°C 的温度下。
8. 封闭液：1X TBS/0.3% Triton X-100/5% Normal Goat Serum (#5425)。制备方法：将 500 µl 的山羊血清和 30 µl 的 Triton X-100 加入到 9.5 ml 的 1X TBS 中。
9. 检测系统：SignalStain^® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Mouse #8125; HRP, Rabbit #8114)。
10. 基质：SignalStain^® DAB Substrate Kit (#8059)。

B. 切片制作

1. 针对储存在 -80°C 温度下的组织：切片前，从冷冻柜中取出组织样品，在 -20°C 的温度下均衡约 15 分钟。这样可以防止切片在封闭时破裂。
2. 将组织切成厚度在 6–8 µm 之间的切片，置于带正电荷的载玻片上。
3. 固定前，将切片放置在工作台上风干几分钟（这样可以增加切片的粘附作用）。

C. 固定剂的选择

注：请参考产品数据表，确定最佳的固定剂。

1. 组织切片晾干后，按照以下步骤使用最佳的固定剂固定。
   1. 10% 中性缓冲福尔马林：在室温下固定10 分钟。立即进入染色步骤（D 部分）。
   2. 冷冻丙酮：-20°C 温度下，冷冻 10 分钟。风干。立即进行染色（D 部分）。
   3. 甲醇：-20°C 温度下，冷冻 10 分钟。立即进行染色（D 部分）。
   4. 3% 甲醛：在室温下固定15 分钟。立即进行染色（D 部分）。
   5. 3% 甲醛/甲醇：在3% 甲醛溶液中室温固定 15 分钟，之后在 -20°C 的温度下在甲醇溶液中固定 5 分钟（转移过程中不要冲洗）。立即进行染色（D 部分）。

D. 染色

1. 用洗涤缓冲液清洗切片两次，持续 5 分钟。
2. 在甲醇/过氧化物酶中室温孵育 10 分钟。
3. 用洗涤缓冲液清洗切片两次，持续 5 分钟。
4. 在每个切片上滴加 100–400 µl 封闭液，在室温下封闭 1 小时。
5. 清除封闭液，然后每个切片加入用封闭液稀释的 100–400 µl 的一抗。
6. 4°C 孵育过夜。
7. 将 SignalStain^® Boost Detection Reagent 平衡至室温。
8. 清除抗体溶液，在洗涤缓冲液中清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
9. 根据需要，滴入 1-3 滴 SignalStain^® Boost Detection Reagent。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain^® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain^® DAB Diluent 中，使用前充分混合。
12. 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain^® DAB，并密切观察，通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
13. 将切片浸入 dH₂O 中。
14. 如有需要，可根据制造商的说明使用苏木精对切片进行复染。
15. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
16. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
17. 用盖玻片盖住切片。