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胞内流式细胞术的使用

胞内流式细胞术可用来检测与凋亡、多能性状态和表观遗传活性有关的独特信号转导活动。可在某个细胞群的不同细胞类型中分析这些特征，因此可比较不同细胞类型中的工作机制。

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根据细胞表面标记物表达，流式细胞术有助于使表型与功能性输出（如细胞因子释放、转录因子的产生或磷酸化所致的激活）相关联。下面是胞内标记在某个特殊免疫细胞群中选择性表达的例子。在某些情况下，这些标记决定了细胞功能和激活状态。

Btk 在 B 细胞中选择性表达。

Btk 在 B 细胞中选择性表达。

Btk (D3H5) Rabbit mAb #8547： 人全血细胞按照 CST 的流式细胞术备选实验步骤中的说明进行固定和通透处理，并使用 #8547 染色。前向散射 (FSC) 和侧向散射 (SSC) 用于对淋巴细胞设门 (A)。样品用 CD3-PE 和 CD19-APC 共染色，以区分 T 和 B 细胞亚群 (B)。B（红色）和 T（蓝色）细胞群设门用于表示 Btk 平均荧光强度的柱状图 (C)。

FoxP3 在调节性 T 细胞中选择性表达。

FoxP3 在调节性 T 细胞中选择性表达。

FoxP3 (D608R) XP® Rabbit mAb #12653： 使用 CD25 抗体和 #12653 对小鼠脾脏淋巴细胞进行流式细胞分析。Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab’)2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 用作二抗。对设门的 CD4+ 淋巴细胞 (A) 和 CD4- 淋巴细胞 (B)（作为内部阴性对照）进行分析。#12653 能够对 FoxP3+/CD25+ Treg 细胞的信号强度和细胞群频率进行最佳检测。
FoxP3 (D608C) XP® Rabbit mAb #12632： 对 CD4+ 淋巴细胞门控型人外周血单核细胞进行流式细胞分析，结果表明使用 #12632 (C) 在 CD25+ 细胞中检测到 FoxP3 表达，而使用浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900(D) 在 CD25+ 细胞中检测到相应信号缺失。#4412 用作二抗。FoxP3 (D608C) Rabbit mAb #12632 明确确定了 FoxP3+/CD25+ 亚群的信号强度和细胞群频率。

使用 CST 的转录因子实验步骤同时检测 CD4+CD25+ 调节性 T 细胞中的磷酸化 S6（AKT 的一种下游底物）和转录因子 FoxP3。

同时检测磷酸化 S6

染色后，分离的小鼠脾细胞在绿色通道中用于 CD25 检测，针对 CD4+ T 细胞（门控细胞）进行富集，随后不作处理（顶部小图）或在 CD3 包被的培养板上用 IL-2 处理 (20 ng/ml)（底部小图）。细胞随后进行固定、通透并用偶联 Alexa Fluor® 647 #13399 的 FoxP3 (D608R) XP® rabbit mAb 和偶联 PE #5316 的 Phospho-S6 ribosomal protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP® rabbit mAb 染色。 小鼠脾细胞模型系统由日本东京新宿区庆应大学医学院微生物学和免疫学部门的 Ryusuke Nakagawa 博士惠赠。

表观遗传学是一种组蛋白和 DNA 修饰研究，这些修饰会促进染色质凝聚和松弛，因此分别调控基因沉默和转录。

越来越多的研究正在使用流式细胞术来读取整体表观遗传修饰 (1-3)。流式细胞术

人全血细胞按照 Cell Signaling Technology 的流式细胞术备选实验步骤进行固定和通透，并用 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27)(C36B11) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #12158 染色。前向/侧向散射光淋巴细胞设门用于表示 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27)（蓝色）和浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #2985（红色）的平均荧光强度的柱状图。

参考文献：

  1. Obier N, Müller AM (2010) Chromatin flow cytometry identifies changes in epigenetic cell states. Cells Tissues Organs (Print) 191(3), 167–74.
  2. Dispirito JR, Shen H (2010) Histone acetylation at the single-cell level: a marker of memory CD8+ T cell differentiation and functionality. J. Immunol. 184(9), 4631–6.
  3. Watson M, Chow S, Barsyte D, Arrowsmith C, Shankey TV, Minden M, Hedley D (2014) The study of epigenetic mechanisms based on the analysis of histone modification patterns by flow cytometry. Cytometry A 85(1), 78–87.

干细胞显示出两个独特特性：(1) 效能，定义为分化成不同细胞系的潜能；和 (2) 在培养中无限繁殖的自我更新能力。

胚胎干细胞 (ESC) 能分化成体内任何细胞类型，因此在本质上具有多能性。在各种生物诱因的刺激下，胞内流式细胞术可用来跟踪 ESC 的多能性状态（见下文例子）。

NTERA

NTERA-2 分化检测。
NTERA-2 是一种多能性人胚胎癌细胞系，可在视黄酸 (RA) 的刺激下分化成神经外胚层细胞系。将这些细胞暴露在 RA (5 μM) 下超过 5 天会导致 Sox2 和 Oct4（点状图，A）与 Nanog 和 SSEA4（柱状图，B）多能性标记物的表达逐渐下降，导致出现双阴性、完全分化的神经元细胞。

凋亡是一种严格受控的细胞自杀模式，以核固缩、细胞皱缩、细胞膜起泡和 DNA 片段化为特征。Caspases 是一个半胱氨酸蛋白酶家族，是这种过程的主调节分子。

使用流式细胞术（通常连用细胞活性染料）检测凋亡标记已成为这一研究领域的一种常见做法。

Annexin V-FITC Early Apoptosis Detection Kit #6592： 使用 #6592 对未经处理（左图）或已经 camptothecin（10uM，4 小时；右图）处理的 Jurkat 细胞进行流式细胞分析。

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Cleaved Caspase-3 (Asp175) (D3E9) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #9603。使用 #9603 对未经处理（蓝色）或已经 etoposide #2200（绿色）处理的 Jurkat 细胞进行流式细胞分析。