成功进行流式细胞术的技巧

体外刺激全血会干扰血基质中的外周血细胞，导致模型在通路信号转导和其他细胞过程方面更具生理相关性。用 4% 甲醛固定会让蛋白质相互作用变得稳定，并且随后用 0.1% Triton X-100 处理会裂解红细胞 (RBC) (1)。用 50% 甲醇进行通透可保留表面标记物完整性，从而同时分析表面和胞内靶标

胞内酪氨酸激酶 Btk 在 B 细胞中选择性表达

Btk (D3H5) Rabbit mAb #8547： 人全血细胞按照 CST 的流式细胞术备选实验步骤中的说明进行固定和通透处理，并使用 #8547 染色。前向散射 (FSC) 和侧向散射 (SSC) 用于对淋巴细胞设门 (A)。样品用 CD3-PE 和 CD19-APC 共染色，以区分 T 和 B 细胞亚群 (B)。B（红色）和 T（蓝色）细胞群设门用于表示 Btk 平均荧光强度的柱状图 (C)。

参考文献：

1. Chow S, Hedley D, Grom P, Magari R, Jacobberger JW, Shankey TV (2005) Whole blood fixation and permeabilization protocol with red blood cell lysis for flow cytometry of intracellular phosphorylated epitopes in leukocyte subpopulations. Cytometry A 67(1), 4–17.

设计实验时，解释细胞系统的复杂性始终很重要。在某些情况下，基底修饰水平可能会很高，因此，刺激目的通路不会提供任何其他可检测的信号，这可以解释为是一个假阴性结果。对于磷酸化蛋白，这是一个常见的现象。要解决这个问题，固定和通透的样品可用磷酸酶处理，以去除蛋白的磷酸基，随后检测指示高基底磷酸化水平的信号是否减弱。血清饥饿或激酶抑制剂处理会降低活细胞中的内源性磷酸化水平。相反，由于存在内源性磷酸酶活性，可能会难以捕捉瞬变的磷酸化活动，在这种情况下，用磷酸酶抑制剂处理有助于维持磷酸化信号。

磷酸酶处理显示 S6 核糖体蛋白的基底磷酸化水平。

Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236)(D57.2.2E) XP^® Rabbit mAb (Alexa Fluor^®488 Conjugate) #4803： 人全血细胞按照 CST 流式细胞术备选实验步骤进行固定和通透，随后不作处理 (A)、或用 λ 磷酸酶 (B) 或 TPA #4174 (C) 处理，之后用 #4803 染色。

对照可让研究人员确定存疑的测定法是否能正常发挥作用。如果要考虑很多因素，精心的对照设计对解释流式细胞实验的结果尤为重要。考虑到这一点，我们建议在您的工作流程中加入以下类型的对照：

1. 设置或仪器对照，用于正确调整仪器电压增益和补偿
2. 设门对照，用于区分特异性和非特异性结合
3. 实验对照，提供具有生物学意义的信息。

下表列出了有关以上三类的每类的相应对照。