Cell Signaling Technology

XP®单克隆抗体的卓越特异性

XP® 单克隆抗体的卓越特异性

针对磷酸化蛋白的抗体经常与相关的蛋白发生交叉反应,导致交叉反应条带或者假阳性条带出现。我们将两个XP®单克隆抗体Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP® Rabbit mAb #4370Phospho-Met (Tyr1234/1235) (D26) XP®Rabbit mAb #3077与许多相关研究应用的竞争产品做比较。

Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP® Rabbit mAb #4370

  CST #4370 竞争对手1 竞争对手2
免疫印迹稀释度 1:2000 1:100 1:100
分析浓度 (µg/mL) 0.222 1 10
推荐应用 W, IP, IHC-P, IF-IC, F W, IP, IF W, IHC-P, IHC-F
种属交叉反应 H, M, R, Hm, Mk, Mi, Dm, Z, B, Dg, Pg, Sc, (Ce) H, M, R, Dg H, M, R, (C, X, Z)
Side by side western blot analysis of XP® #4370 vs competitors

图1.左边泳道的Jurkat细胞未处理,右边泳道的Jurkat细胞用200nM佛波酯TPA #4174处理10分钟并撤除血清过夜,从而诱导p44/42蛋白的磷酸化。#4370使用的是推荐的稀释度,而两个竞争对手的抗体使用的是厂家推荐稀释度范围中的最高浓度。所有的抗体显示了TPA处理后应该诱导出现的信号。两个竞争对手的抗体都出现很强的背景,竞争对手1出现许多交叉反应的条带,而竞争对手2信号整体较弱。

Side by side immunofluorescent comparison of XP® #4370 vs competitors

图2.HeLa细胞用10µM MEK 1/2抑制剂U0126 #9903处理2小时或用200nM TPA #4174处理30分钟后,撤除血清后过夜。#4370 使用最佳的IF-IC推荐浓度1:200,而竞争对手1的抗体测试了厂家推荐的稀释范围1:50-1:500(数据未给出)。在测到最佳浓度时,竞争对手的抗体在U0126处理的细胞中出现了更多的背景染色,包括细胞核和细胞质中,并且在刺激的细胞中只有微弱的,扩散的细胞质染色。TPA处理后用#4370检测到应该出现的诱导信号,而竞争对手的抗体检测到很少的诱导信号,而且抗体信号整体更脏。

 
Side by side immunohistochemical assays comparison of XP® #4370 vs comptetitors

图3. #4370与竞争对手可用于免疫组化上的抗体在两个浓度下进行比较。免疫组化分析#8103 【TPA #4174(上)或U0126 #9903(中)处理的石蜡包埋的NIH/3T3细胞)】和石蜡包埋的人类卵巢癌样品(下)。在最佳的推荐稀释度1:400,#4370显示了在细胞颗粒系统中适当的染色。竞争对手2的抗体需要1:400稀释度来消除阴性对照——U0126处理细胞的染色。然而,阳性对照——TPA处理的细胞中的信号在这个稀释度明显减弱。稀释度为1:100(最低推荐稀释度)时,竞争对手2抗体的染色在人类卵巢癌组织中信号微弱,与从U0126处理细胞观察到的染色信号相比,这不能作为是特异的信号。竞争对手2抗体稀释度为1:400时基本看不到组织染色。相反,#4370在人类卵巢癌中显示了强的特异染色信号。

Side by side western blot analysis using a panel of recombinant tyrosine-phosphorylated proteins

图4. 用#4370一组重组酪氨酸磷酸化蛋白进行免疫印迹的结果显示,没有检测到交叉反应,而用两个竞争对手的抗体都可以检测到很强的与其他酪氨酸磷酸化蛋白的交叉反应。Phospho-Tyrosine Mouse mAb (P-Tyr-100) #9411用来证明蛋白上样并确定标签重组蛋白的分子量。这些结果表明#4370具有卓越的特异性。

Phospho-Met (Tyr1234/1235) (D26) XP® Rabbit mAb #3077

Extracts treated with growth factors vs Competitor

图5. 在HGF刺激的A431细胞中用#3077做免疫印迹实验可以观察到在145 kDa的位置有一条单一的条带,而在未刺激的细胞中则观察不到(上)。而使用可以激活其他RTKs,或过表达其他RTKs或细胞质酪氨酸激酶的细胞因子处理的提取物的结果为阴性。通过比较,竞争对手的phospho-Met抗体可以检测到一些非特异性的条带(下)。两张膜在相同的胶片上进行实验,且经过相同的曝光时间(10秒钟)。

Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded MKN45 cells

图6. 免疫组化分析石蜡包埋的经Met抑制剂SU11274处理的MKN45细胞,结果表明#3077和竞争对手抗体都没有检测到比对照更多的染色信号。MDA-MB-468和T47D乳腺癌细胞系各自分别经过EGF处理和HRG处理,结果使用#3077没有检测到比对照增加的染色信号。相反,竞争对手的抗体经过两种处理后都检测到非特异性的染色,说明它与其他RTKs有交叉反应。

Cell Signaling Technology #3077 HCC827 xenograft vs Competitor

图7. 石蜡包埋的HCC827异种移植物的免疫组化结果表明#3077(左)和竞争对手抗体(右)都出现了特异染色。

Phosphatase treatment of paraffin-embedded human lung carcinoma using #3077

图8.磷酸酶处理的石蜡包埋的人肺癌样品证实了#3077的磷酸化特异性。

 

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