Cell Signaling Technology

免疫荧光分析抗体的验证

免疫荧光(IF)涉及使用特异性一抗和荧光标记的二抗(间接法)或者直标一抗(直接法)标记细胞内蛋白。许多荧光显微镜允许在单个样本中检测亚细胞定位、相对表达水平和/或两个或三个活化状态(例如磷酸化状态)的荧光标记蛋白。

当研究组织中细胞亚群的多个标记物时,因为IF具有同时检测多个分析物的能力,因此不需要连续的样本,而且节约时间和试剂。Cell Signaling Technology(CST)的科学家已经验证超过800种特异的活化状态抗体(例如:特异的磷酸化抗体)和总蛋白抗体用于IF,如手动荧光显微镜或自动成像和激光扫描高内涵分析平台。所有CST™批准的用于IF的抗体,都经过了严格的验证。

验证步骤包括:

  • 已知目标蛋白表达水平的细胞系或组织被用来验证特异性。
  • 适当的细胞系和组织被用来验证亚细胞定位。
  • 在适当的组织上进行抗体性能评估。
  • 用磷酸酶处理细胞,以验证磷酸化特异性。使用公知的基因敲除或缺失细胞株验证靶特异性。
  • 使用siRNA处理或过度表达的细胞,以验证特异性。
  • 使用配体或抑制剂调节细胞信号通路活性,然后检测活化状态蛋白抗体的特异性,目标蛋白的表达和易位。
  • 对抗体信噪比阈值的要求:与同型对照进行比较,磷酸化特异性抗体最小的提高倍数,确保最大可能性的灵敏度。
  • 对固定和通透条件的优化;如果必要,提供可替代的操作步骤。
  • 严格的测试,确保批次间的一致性。

磷酸酶处理和基因敲除细胞

Phospho-GSK-3β (Ser9) (D85E12) XP® Rabbit mAb #5558:激光共聚焦免疫荧光分析野生型小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs) (上排),GSK-3β (-/-) MEFs (中排),或者PC-3 细胞(下排),未经处理的 (左),用LY294002(PI3 激酶抑制剂)#9901Wortmannin #9951处理的 (中) 或 λ 磷酸酶处理的 (右),所用抗体为Phospho-GSK-3β (Ser9) (D85E12) XP ® Rabbit mAb #5558(绿色).蓝色伪彩是DRAQ5 ® #4084 (荧光 DNA 染料). (MEF 野生型,GSK-3α (-/-) 和GSK-3β (-/-) 细胞是由加拿大多伦多大学Dr. Jim Woodgett,友情提供)。

 

亚细胞定位

Cell lines and tissues used to verify subcellular localization.

图 A. - COX IV (3E11) Rabbit mAb #4850
图 B. - ERp72 (D70D12) XP® Rabbit mAb #5033
图 C. - ZO-3 (D57G7) XP® Rabbit mAb #3704

组织

Pdx1 Antibody #2437 performance is assessed on appropriate tissues.

 

Pdx1 Antibody #2437: 激光共聚焦免疫荧光分析正常大鼠胰腺,使用 Pdx1 Antibody #2437 (绿色,上图) 或者 Insulin (C27C9) Rabbit mAb #3014 (绿色,下图)。角蛋白纤维使用Pan-Keratin (C11) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4528 (蓝色)标记。红色是 Propidium Iodide/RNase #4087 (荧光DNA染料)。

 

操作步骤优化

PDI #2446 and β-Actin #3700 performance is assessed on appropriate tissues.

 

PDI Antibody #2446 β-Actin (8H10D10) Mouse mAb #3700: 激光共聚焦免疫荧光分析NIH/3T3 细胞,使用甲醇(上图)或0.3% Triton X-100(下图)进行通透,使用的抗体是#2446 (绿色) 和 #3700 (红色)。蓝色伪彩是DRAQ5® #4084 (荧光DNA染料)。

 

 

 

技术服务 

 

 

 

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