Cell Signaling Technology

“酶”处理染色质免疫沉淀(琼脂糖微球式)操作方法

“酶”处理染色质免疫沉淀(琼脂糖微球式)操作方法

所需试剂

包含在试剂盒 SimpleChIP™ Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002中的试剂:

  1. 甘氨酸溶液(10X)
  2. 缓冲液A(4X)
  3. 缓冲液B(4X)
  4. ChIP缓冲液(10X)
  5. ChIP洗脱(缓冲)液(2X)
  6. 5 M NaCl
  7. 0.5 M EDTA
  8. #7016,DTT粉末,192.8mg,(4C保存,溶解后-20C保存)
  9. DNA结合(缓冲)液
  10. DNA漂洗(缓冲)液
  11. DNA洗脱(缓冲)液
  12. DNA纯化柱
  13. 蛋白酶混合抑制剂(200X)
  14. 核糖核酸酶A(10 mg/ml)
  15. 微球菌核酸酶(2000 gel units/μl):NEB #M0247S
  16. 蛋白酶K(20 mg/ml):NEB #P8102S
  17. 人对照基因RPL30外显子3引物
  18. 小鼠对照基因RPL30内含子2引物
  19. 组蛋白H3(D2B12)XP™兔单抗(ChIP专用) #4620
  20. 正常兔IgG #2729
  21. ChIP级蛋白G琼脂糖微球 #9007

不包含在试剂盒SimpleChIP™ Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002中的试剂:

  1. PMSF (0.1 M,溶剂乙醇)
  2. 37%的甲醛溶液
  3. 乙醇(96-100%)
  4. 1X PBS
  5. 无核酸酶的水
  6. Taq DNA聚合酶
  7. dNTP(三磷酸脱氧核苷酸)混合液

A. 体内交联,细胞核制备并用核酸酶S7消化染色质

开始之前:

每次实验需要刺激或处理大约4X 107个细胞。这些细胞中提取的染色质可以用于多达10次单独的免疫沉淀实验。

取出并需预热的试剂:

为每4 X 107细胞准备以下试剂,并在冰上预冷(5个培养皿):

·         10 ml 10X 甘氨酸溶液

·         200 ml 1X PBS(自备)

·         10 ml 1X PBS + 100 μl PMSF 

·         10 ml 1X 缓冲液 A (2.5 ml 4X缓冲液 A + 7.5 ml 水) + 5 µl 1 M DTT + 50 µl 200X 蛋白酶混合抑制剂l (PIC) + 100 µl PMSF

·         11 ml 1X 缓冲液 B (2.75 ml 4X 缓冲液 B + 8.25 ml 水) + 5.5 µl 1 M DTT

·         1 ml 1X ChIP 缓冲液 (100 µl 10X ChIP 缓冲液 + 900 µl 水) + 5 µl 200X 蛋白酶混合抑制剂 (PIC) + 10 µl PMSF.

  1. 为了使蛋白与DNA交联,向每个含有20 ml培养基的15cm培养皿中加入540 µl 37%的甲醛溶液。稍加转动培养皿使之混匀,室温放置10分钟。
    • 甲醛的终浓度为 1%.
    • 使用新鲜未过产品保质期的甲醛溶液
    • 加入甲醛后,培养基的颜色会发生改变。
  2. 每个盘中加入2 ml 10X 甘氨酸溶液稍加转动使之混匀,室温孵育5分钟。
  3. 加入甘氨酸后,培养基的颜色会发生改变。
  4. 对于贴壁细胞,弃去培养基后用冰冷的PBS漂洗两次(20 ml /次),彻底弃净PBS。对于悬浮细胞,4℃ 1500rpm离心5分钟,沉淀用冰冷的PBS漂洗两次。
  5. 每盘细胞中加入2 ml冰冷的1X PBS + PMSF,将细胞刮下并将5盘细胞收集到一个15 ml的锥底管中。悬浮细胞直接将细胞重悬到2 ml的冰冷缓冲液中合并即可。
  6. 4°C 1500rpm离心5分钟。弃上清,并将细胞重悬在10 ml冰冷缓冲液 A + DTT + PIC + PMSF中。冰上孵育10分钟。每3分钟颠倒混匀一次。
  7. 4°C 3000rpm离心5分钟以沉淀细胞核。弃上清,并将沉淀重悬在10 ml冰冷的缓冲液B + DTT中。再次离心,弃上清,并将沉淀重悬在1.0 ml 缓冲液 B + DTT中。将样品转移到1.5 ml离心管中。
  8. 需要做预实验确定将不同细胞系DNA酶切到理想长度所需微球菌核酸酶的酶量(参照附录A)。
  9. 4 X 107个HeLa细胞核用5 µl微球菌核酸酶在1 ml缓冲液 B + DTT中消化可以得到合适长度的DNA片段。
  10. 加入5 µl微球菌核酸酶,颠倒混匀数次,37°C孵育20 min,每隔3~5分钟颠倒混匀一次,将DNA消化成长度约为150-900 bp的片段。
  11. 加入100 µl 0.5 M EDTA终止消化,将离心管置于冰上。
  12. 4°C 13000rpm离心1分钟,沉淀细胞核。弃上清。
  13. 可以在超声前后利用光学显微镜观察细胞核以判断完全破碎细胞核所需的最佳条件。
  14. 利用VirTis Virsonic 100超声破碎仪,设置模式6,1/8英寸的探头,对Hela细胞核进行每次20秒,共3次的超声处理可以达到完全破碎的效果。
  15. 或者也可以用杜恩斯型匀浆器处理细胞核20次,但是这种破碎效果可能不如超声处理完全。
  16. 将细胞核沉淀重悬在1 ml 1X ChIP 缓冲液 + PIC + PMSF中,然后将样品一分为二,向两个离心管各分装500 µl。冰上孵育10分钟。
  17. 对每管细胞核样品用超声波处理数次以破碎核膜。在每次超声处理操作之间,将样品在冰上孵育30秒。
  18. 4°C 10000rpm离心10分钟,使样品澄清。
  19. 将上清转移到一个新管子中,即为交联的染色质样品。在下一步使用之前需要保存在-80°C。取50 µl用以分析DNA的酶切情况并确定其浓度(参照B部分)。

B. 分析染色质的浓度和酶切情况(推荐步骤)

  1. 向50 µl的染色质样品中(来自A部分第13步)加100 μl无核酸酶的水,6 μl 5 M NaCl 和 2 μl RNAse A。涡旋震荡混匀, 37°C孵育30分钟。
  2. 向RNAse A消化后的样品中加入2 μl 蛋白酶K。涡旋震荡混匀, 65°C孵育2小时。
  3. 按照F部分的说明利用离心柱纯化DNA。
  4. DNA样品纯化后,取10 µl与1 kb DNA Marker进行1%琼脂糖凝胶电泳以确定DNA片段大小。DNA应当被酶切成长度约为150-900 bp的片段(1~5个核小体长度)
  5. 测定DNA浓度时,将2 µl纯化后的DNA加入到98 µl TE缓冲液中(即稀释50倍),然后读取OD260收值。将OD260乘以2500即得到以μg/ml表示的DNA浓度。理想的DNA浓度应当在100~200 μg/ml之间。

注意:要得到理想的ChIP结果,合适长度和浓度的染色质样品至关重要。过度消化可能会减弱PCR定量信号。而消化不足可能会导致过高的背景信号并降低分辨率。加入到IP体系中的染色质太少也可能导致不能产生PCR定量信号。优化染色质消化条件的操作方法请参照附录A。

C. 染色质免疫沉淀

开始之前:

从冰箱中取出并预热:

从冰箱中取出并置于冰上

注意:交联的染色质样品也可以不按照下面的描述稀释,将抗体直接添加到未稀释的染色质样品中沉淀染色质复合物。

  1. 在一个样品管中先为所需的免疫沉淀反应准备足够的1 X ChIP缓冲液。每个沉淀反应需要400 μl 1 X ChIP 缓冲液(40 µl 10X ChIP缓冲液 + 360 µl水)和2 µl的蛋白酶混合抑制剂。在确定免疫反应数时,应当包括阳性对照组蛋白H3 (D2B12) XP™ 兔单抗 (ChIP专用) #4620和阴性对照抗体正常兔IgG #2729样品。混匀后置于冰上。
  2. 在配好的ChIP缓冲液中,每反应加入100μl交联后的染色质样品(10~20ug的染色质DNA,来自A部分第13步)。例如, 10个免疫沉淀反应就需要准备一个含有4 ml 1 X ChIP 缓冲液的离心管(400 µl 10 X ChIP 缓冲液 + 3.6 ml 水)+ 20 μl 蛋白酶混合抑制剂 + 1 ml 消化后的染色质样品。
  3. 吸取10 µl稀释后的样品并转移到一个微量离心管中。这就是2%样品输入对照,使用之前可以保存在-20°C (用于E部分的第一步)。
  4. 分装每个免疫沉淀反应所需要的500 µl稀释的染色体样品到各个离心管中并加入对应的抗体。每种抗体做免疫沉淀时所需用量有差异,需要用户在使用时加以调整。对于阳性对照组蛋白H3 (D2B12) XP™ 兔单抗 (ChIP专用) #4620,加入10 µl即可。对于阴性对照正常兔IgG #2729,需加1 µl (1 µg)~5 µl (5 µg)。在4°C的转子上孵育4小时以上或过夜。
  5. 加入30 μl的ChIP级的蛋白G琼脂糖微球 #9007,在4°C的转子上孵育2小时。
  6. 开始D部分操作。

D. 漂洗免疫沉淀的染色质:

开始之前:

从冰箱中取出并预热:

为每个免疫沉淀反应准备并在冰上预冷:

E. 将染色质从抗体/蛋白G微球上洗脱并解交联

开始之前:

F. 用离心柱纯化DNA

开始之前:

G. 用PCR定量DNA

建议:

引物长度: 24个核苷酸
最佳Tm值: 60°C
最佳GC含量: 50%
扩增片段长度: 150-200 bp(用于常规PCR) 80-160 bp (用于实时定量PCR)

常规PCR操作:

  1. 按样品数取出合适数目的0.2 ml PCR管并做好标记。注意包括2%样品输入对照组,阳性对照组蛋白H3样品组,阴性对照正常兔IgG样品组,以及一个监控DNA污染的无DNA模板的空白组对照。
  2. 在每管中加入2μl对应的DNA样品。
  3. 按下面配比配置PCR反应液总管,记住计算时多算两份以补偿分管时的体积损失。配好后,向每个PCR管中加入18μl反应液混合物。
试剂 每个PCR反应(20 μl)所需体积
无核酸酶的水 12.5 μl
10X PCR 缓冲液 2.0 μl
4 mM dNTP混合液 1.0 μl
5 μM RPL30引物 2.0 μl
Taq DNA聚合酶 0.5 μl
  1. 设定并执行以下PCR反应程序:
a. 预变性 95°C 5 分钟
b. 变性 95°C 30 秒
c. 退火 62°C 30秒
d. 延伸 72°C 30秒
e. 重复2-4步,共34个循环    
f. 终末延伸 72°C 5 分钟

 

  1. 从每个反应管中取10 μl PCR产物,2%琼脂糖凝胶或10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,用100 bp DNA Marker做对照。人、小鼠RPL30的PCR产物大小分别为161、159 bp。

实时定量PCR方法:

  1. 选与所用定量PCR仪配套的PCR管或板,做好标记。注意加入阳性对照组蛋白H3样品组,阴性对照正常兔IgG样品组,以及监控DNA污染的不加DNA模板的空白组对照。另外在加入反应体系前,将2%样品输入对照做一系列稀释(不稀释,1:5,1:25,1:125),据此可以产生标准曲线并测算PCR扩增效率。
  2. 在每个反应管或孔(板上)中加入2 μl相应DNA模板。
  3. 按下面配比配置PCR反应液总管,记住计算时多算两份以补偿分管时的体积损失。配好后,向每个PCR管中加入18 μl反应液混合物。
试剂 每个PCR反应(20 μl)所需体积
无核酸酶的水 6 μl
5 μM RPL30 引物 2 μl
SYBR-Green反应体系 10 μl
  1. 按下面程序执行PCR
a. 预变性 95°C 3 分钟
b. 变性 95°C 10 秒
c. 退火及延伸: 60°C 30 秒
d. 重复第2及第3步,共40个循环  
  1. 用定量PCR仪自带的程序分析定量结果。

附录A:染色质消化条件优化

将交联后的DNA消化成长度为150-900 bp片段所需最优条件取决于细胞类型、密度和微球菌核酸酶的浓度。以下操作步骤可以用于优化既定细胞类型和密度的消化条件。

  1. 先用4 X 107个细胞制备交联的细胞核,按照A部分第1到6步操作。
  2. 将上述第6步得到的200 μl核提取物分装到5个不同的微量离心管中,置于冰上。
  3. 把5 μl微球菌核酸酶加入到20 μl 1 X 缓冲液 B + DTT中(1:5稀释)。
  4. 向第2步所得的5个微量离心管中分别加入0 μl,2.5 μl,5 μl,7.5 μl或10 μl稀释后的微球菌核酸酶,颠倒几次混匀,然后在37°C孵育20分钟,期间经常的颠倒混匀。
  5. 加入20 μl 0.5 M EDTA终止消化,置于冰上。
  6. 4°C 13000rpm离心1分钟,沉淀细胞核并去除上清。
  7. 将细胞核沉淀用200 μl 1X ChIP 缓冲液 + PIC +PMSF重悬。在冰上放置10分钟。
  8. 用超声波处理样品数次以破碎细胞核膜。在每次超声处理之间,将样品置于冰浴内降温30秒。
    • 可以在超声前后用显微镜观察核以判断完全破碎细胞核所需的最佳条件。
    • 利用VirTis Virsonic 100超声破碎仪,设置模式6,1/8英寸的探头,对Hela细胞核进行每次20秒,共3次的超声处理可以达到完全破碎的效果。。
    • 或者也可以用杜恩斯型匀浆器处理细胞核20次,但是这种破碎效果可能不如超声处理完全。
  9. 4°C 10000rpm离心10分钟,使样品澄清。
  10. 各取50 μl超声裂解物的上清转移到新的离心管中。
  11. 向每个50 μl样品中加入100μl无核酸酶的水,6 μl 5 M NaCl 和 2 μl RNAse A。涡旋震荡混匀, 37°C孵育30分钟。
  12. 向RNAse A 消化后的样品中加入2 μl 蛋白酶K。震荡混匀后在65°C孵育2小时。
  13. 取20 μl样品、1 kb DNA marker跑1%琼脂糖胶电泳,观察酶切后DNA片段的大小。
  14. 从电泳带型上判断何种消化条件生成所需要的150-900 bp带型(1~5个核小体长度)。优化所得稀释的微球菌核酸酶体积即为下一步实验中用于4 X 107个细胞消化所用的微球菌核酸酶原液体积数。比如说,如果在本次实验中,用5 μl稀释后的微球菌核酸酶处理后得到150-900 bp带型,则在A部分的第7步则应加入5 μl微球菌核酸酶原液。
  15. 假如结果显示所用条件未能达到理想的消化结果,则相应调整每组消化所用酶量,重做条件优化实验。

附录B:常见问题及解决方案

问题 可能的原因 改进建议
所得消化后的染色质样品浓度过低 用于消化的细胞太少或者消化后细胞核没有完全裂解 如果染色质样品DNA浓度接近于200 μg/ml,则增加染色质的加入体积使每个反应中的DNA含量达到20μg。
在交联之前,对备用盘细胞计数确定实际所用的准确细胞数,并在超声处理前后用显微镜观察,确保细胞核已完全裂解。
染色质消化不够并且所得片段过长(大于900 bp) 细胞被过度交联。交联处理时间超过10分钟可能会抑制染色质消化。 缩短交联处理的时间为10分钟。
消化时,细胞太多或微球菌核酸酶太少 在交联之前,对备用盘细胞计数确定实际所用的准确细胞数。可参考附录A在实验前优化消化条件。
染色质消化过度,片段太小(都是150bp左右,一个核小体长度的片段)。将染色质完全消化成单核小体长度的片段会导致PCR定量时信号消失,特别是当PCR扩增片段大于150 bp时。   消化时,细胞太少或微球菌核酸酶太多 在交联之前,对备用盘细胞计数确定实际所用的准确细胞数。可参考附录A在实验前优化消化条件。
样品输入对照组没有PCR产物或很少产物。 PCR反应所加DNA模板量不足或是PCR条件不合适 增加PCR反应中DNA模板量或扩增循环数  
PCR所扩增的区域可能跨过了无核小体区域(在酶切时被切断) 以交联并消化后的染色质为模板优化所用引物的PCR条件。设计一对新的引物,使扩增片段的长度少于150bp(参考G部分引物设计建议)。
加入到免疫沉淀体系中的染色质太少或者染色质被过度消化 参考问题1、3的改进建议。
阳性对照组蛋白H3抗体免疫沉淀组RPL30基因PCR扩增没有条带 加入到免疫沉淀体系中的染色质太少,或者抗体加的太少,或者免疫沉淀反应时间太短 用于每个IP的染色质至少需要20 μg,抗体不少于10 μl。抗体与染色质需要孵育过夜,加入蛋白G微球后再放两个小时。
染色质从蛋白G微球上洗脱不完全 最佳的洗脱条件是将样品放在65°C并经常混匀使微球悬浮在溶液中
阴性对照兔IgG免疫沉淀组和阳性对照组蛋白H3免疫沉淀组在PCR中得到相近量的产物 加入到免疫沉淀体系中的染色质或抗体太多 每个IP体系中加入的染色质不超过50 μg,抗体不多于10 μl。染色质或抗体太多会导致背景很高。
PCR体系中模板DNA过多或PCR循环数过多 减少PCR体系中模板量或降低循环数。在PCR反应对数增长期分析结果非常重要,否则初始模板量的差异不能被精确检测。
实验抗体免疫沉淀组没有PCR产物 PCR体系中DNA模板量不足。 增加PCR反应中DNA模板量或扩增循环数
免疫沉淀体系中加入的抗体量不足。 通常一个免疫沉淀反应需要的抗体量在1到10 μg之间。但是具体的用量因抗体而异。尝试增加免疫沉淀中的抗体量。
所用抗体不适合免疫沉淀 确认这种抗体在常规的免疫沉淀反应中有效。

 

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