Cell Signaling Technology

流式细胞术方案

流式细胞术方案

A.     所需溶液和试剂

  1. 1X磷酸盐缓冲液(PBS):将8 g氯化钠(NaCl),0.2 g 氯化钾(KCl),1.44 g 磷酸氢二钠(Na2HPO4),0.24 g 磷酸二氢钾(KH2PO4)溶解在800 ml蒸馏水(dH2O)中。用盐酸调节pH到7.4,定容至1升。室温保存。
  2. 甲醛溶液(无甲醇的)
  3. 孵育缓冲液:将0.5 g牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)溶解在100 ml的1 X PBS中。保存在4°C。

B.      固定

  1. 离心收集细胞,弃上清。
  2. 将细胞重悬在0.5-1 ml PBS中。加入甲醛溶液至终浓度为2-4%。
  3. 37°C固定10分钟。
  4. 放在冰上降温1分钟。
  5. 做细胞外染色不需要细胞膜打孔时,继续D1步或将细胞保存在4°C含有0.1%叠氮钠的PBS中;做细胞内染色时,继续C1步给细胞膜打孔。

C.     细胞膜打孔

  1. 边轻轻震荡边将冰冷的100%甲醇缓慢加入到预冷的细胞中,至终浓度为90%。或者也可以在细胞膜打孔前离心去除固定剂,然后将细胞沉淀重悬在90%甲醇PBS溶液中。
  2. 在冰上放置30分钟。
  3. 进入染色步骤或是将细胞在90%甲醇PBS溶液中,-20°C保存。

D.     免疫染色

注意:单克隆抗体设立相应亚型的对照,而多克隆抗体需要对应种属的IgG作为对照。用血球计数法或是其他方法对细胞计数。

  1. 将0.5-1 x 106个细胞分到各检测管中(依照体积)。
  2. 各管加入2-3 ml孵育缓冲液漂洗,离心回收细胞。重复一次。
  3. 将每个管中的细胞重悬在100 µl孵育缓冲液中。
  4. 室温,孵育缓冲液封闭10分钟。
  5. 按合适的稀释比例在检测管中加入未标记,生物素标记或是荧光素标记的一抗。具体的用量参考抗体各自的说明书。
  6. 室温孵育1小时。
  7. 同第二步,用孵育缓冲液清洗,离心回收细胞。
  8. 如果是荧光素标记的一抗,则将细胞重悬在0.5 ml PBS中然后用流式细胞仪检测。如果是未标记或者生物素标记的一抗,则继续D9步。
  9. 用孵育缓冲液按推荐比例稀释荧光素标记的二抗或抗生物素蛋白avidin,将细胞重悬在该稀释液中。
  10. 室温孵育30分钟。离心去除稀释液。
  11. 同第二步,用孵育缓冲液清洗,离心回收细胞。
  12. 将细胞重悬在0.5ml PBS中然后用流式细胞仪检测。或者继续E1步DNA染色。

E.      DNA染色(可选)

  1. 将细胞重悬在0.5 ml DNA染色液中(例如 DRAQ5® #4084)。
  2. 室温至少孵育5分钟。
  3. 流式细胞仪进行分析。

*推荐的二抗:

抗兔:

抗小鼠:

抗大鼠:

 

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