Cell Signaling Technology

天然蛋白的免疫沉淀方法

天然蛋白的免疫沉淀方法

本方法免疫沉淀得到的天然蛋白可用于western免疫印迹或是激酶活性分析

A. 所需溶液和试剂

注意:所有溶液用反渗透去离子水(Reverse Osmosis Deionized water, RODI)或相当纯度的水配制。

1.   20 X 磷酸盐缓冲生理盐水 PBS: (#9808) 配制1L 1 X PBS时,取50 ml 20 X PBS用950 ml RODI水稀释到1L,混匀。

2.   10 X 细胞裂解液: (#9803) 配制1 L 1 X细胞裂解液时,取100 ml 细胞裂解液加950 ml RODI水稀释到1L,混匀。注意:使用前添加1 mM PMSF。

3.   蓝色上样缓冲液(SDS上样缓冲液):(#7722)。 配制新鲜的3 X还原性SDS上样缓冲液,在3X SDS上样缓冲液中加入十分之一的30X的还原剂(1.25M)。

4.   蛋白AG琼脂糖微球(用于未标记的一抗):(处理后可以在4°C保存2星期)。按照产品说明处理。蛋白A用于兔IgG抗体的沉淀,蛋白G用于小鼠IgG抗体的沉淀。

5.   固定有抗生物素蛋白Streptavidin的微球(用于生物素标记的抗体): (#3419) 用前稍加震荡,每个免疫下拉反应用10 μl。

6.   10X 激酶缓冲液:(#9802) 配制1 ml 1X激酶缓冲液时,取100 μl 10 X激酶缓冲液用900 μl RODI水稀释到1ml,混匀。

7.   ATP (10 mM): (#9804) 配制0.5 ml 200 μM ATP时,取10 μl ATP(10 mM)加入到490 μl 1X 激酶缓冲液中。

B. Preparing Cell Lysates细胞裂解物制备

1.   吸去培养基。加入含调节因子的新鲜培养基,处理所需的时间。

2.   在非变性条件下收集细胞,去掉培养基,用冰PBS清洗一次。

3.   去掉PBS,每个板(10cm)中加0.5 ml冰预冷的1 X细胞裂解液,在冰上孵育5分钟。

4.   将所有细胞刮下,收集到一个离心管中。置于冰上。

5.   冰浴中对样品用超声处理3次,每次5秒钟。

6.   4°C,14000 X g离心10分钟。将上清转移到新的离心管中,即为细胞裂解物。如有需要,样品可以保存在-80°C。

C. 免疫沉淀

细胞裂解物预处理(对于未标记或生物素标记抗体而言是可选步骤)

1.   取200 μl 1 mg/ml的细胞裂解物,在其中加入10–30 μl 50%的蛋白A或G琼脂糖微球浆(用于未标记的一抗)或10 μl抗生物素链菌素微球(用于生物素标记的抗体)

2.   4°C孵育30-60分钟。

3.   4°C离心10分钟。将上清转移到新的管中。

4.   根据所用一抗选择下面合适的操作步骤进行实验。

使用未标记一抗

1.   14,000 X g离心1分钟。取200 μl 1mg/ml的细胞裂解物,加入一抗。在4°C转子上孵育过夜

2.   加入蛋白A或G琼脂糖微球(10-30 μl 50% 微球浆)。4°C转子上孵育1-3个小时。

3.   4°C离心30秒。沉淀用500 μl 1 X细胞裂解液洗五次。每次洗好后都置于冰上。

4.   取沉淀进行Western免疫印迹分析或是激酶活性分析(见下文)。

使用生物素标记的一抗

1.   14,000 X g离心1分钟。取200 μl 1mg/ml的细胞裂解物,加入生物素标记的一抗。在4°C转子上孵育过夜。

2.   稍加震荡。加入固定化抗生物素链菌素(与微球偶联)(#3419)(10μl)。在4°C转子上孵育2小时。

3.   4°C离心30秒。沉淀用500 μl 1 X细胞裂解液洗五次。每次洗好后都置于冰上。

4.   取沉淀进行Western免疫印迹分析或是激酶活性分析(见下文)。

使用固定化抗体(与微球偶联)

1.   14,000 X g离心1分钟。取200 μl 1mg/ml的细胞裂解物,加入固定化抗体10 μl。在4°C转子上孵育过夜

2.   4°C离心30秒。沉淀用500 μl 1 X细胞裂解液洗五次。每次洗好后都置于冰上。

3.   取沉淀进行Western免疫印迹分析或是激酶活性分析(见下文)。

D. 样品分析

继续下述任一种操作:

Western免疫印迹分析

1.   将沉淀用20 μl 3X SDS上样缓冲液重悬。震荡后离心30秒。

2.   把样品放在95–100°C加热2-5分钟。14,000 X g离心1分钟。

3.   取样15-30 μl加到SDS-PAGE胶(4–20%)上。

4.   Western 免疫印迹分析检测(参考 Western Immunoblotting方法)。

注意:对于分子量约为50 kDa的蛋白,我们推荐使用小鼠抗兔IgG(轻链特异)(L57A3)mAb #3677或小鼠抗兔 IgG(构象特异)(L27A9)mAb #3678作为二抗,以减少变性重链产生的遮蔽作用。对于分子量接近25 kDa的蛋白,推荐使用小鼠抗兔IgG(构象特异) (L27A9)mAb #3678。

激酶活性分析

1.   沉淀用500 μl 1X激酶缓冲液清洗2次。置于冰上。

2.   将沉淀用添加有200 μM ATP和底物的40 μl 1X激酶缓冲液重悬沉淀。

3.   30°C孵育30分钟。

4.   加入20 μl 3X SDS上样缓冲液终止反应。震荡后离心30秒。

5.   将含有磷酸化底物的上清转移到新的管中。

6.   把样品放在95–100°C加热2-5分钟。14,000 X g离心1分钟。

7.   取样15-30 μl加到SDS-PAGE胶(4–20%)上。

 

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