Cell Signaling Technology

变性蛋白的免疫沉淀方法

变性蛋白的免疫沉淀

当蛋白质处于正常天然构象时,某些抗体所识别的表位未能暴露出来,这种情况下需要采取下列方法进行变性蛋白的免疫沉淀.

A.所需溶液和试剂

注意:所有溶液均需要用Milli-Q超纯水或是相当纯度的其他水配制。

1.   变性细胞裂解液:50 mM Tris (pH 7.5), 70 mM β-巯基乙醇 (β-ME)。β-ME需新鲜加入,加入后先煮10分钟。

2.   细胞裂解液 (1X): 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4,1μg /ml Leupeptin.

注意:使用之前加入1 mM PMSF。

3.   蛋白A琼脂糖微球:取1.5 g 蛋白A琼脂糖微球加入到5 ml的1X PBS中。4°C缓慢搅拌2小时。离心沉淀微球,用PBS清洗两次。将微球重悬在1倍体积的PBS中。(处理后的微球可以在4°C存放2周)

4.   3X SDS上样缓冲液:187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 25°C), 6% w/v SDS, 30% 甘油, 150 mM DTT, 0.03% w/v溴酚蓝。

B. 细胞裂解样品制备

1.   吸去培养基。加入含调控因子的新鲜培养基,处理所需的时间。

2.   在非变性条件下收集细胞,弃去培养基,用PBS清洗一次。

3.   弃去PBS,每个板(150 x 25 mm)中加0.4 ml变性细胞裂解液(使用前预煮10分钟)。

4.   立即将所有细胞刮下,收集到2.5 ml的管中。

5.   沸水中煮10分钟。

6.   加入4倍体积(1.6 ml)冰冷的1 X细胞裂解液。所得即细胞裂解物。如有必要,样品裂解物可以保存在–80°C。

C. 免疫沉淀

1.   将一抗加入到200 μl细胞裂解物中,在4°C的转子上孵育过夜

2.   加入20 μl 50%浆状的蛋白A琼脂糖微球。在4°C的转子上孵育1~3个小时。

3.    4°C离心30秒。沉淀用500 μl细胞裂解液洗五次,洗完置于冰上。

4.   将沉淀用20 μl 3X SDS上样缓冲液重悬沉淀。涡旋震荡,离心30秒。

5.   把样品放在95–100°C加热2-5分钟。

6.   取15-30 μl样品,上样到SDS-PAGE胶(12–15%)上。

7.    Western免疫印迹分析检测(参考 Western Immunoblotting方法)。

 

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