Cell Signaling Technology

PathScan® 夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)抗体配对方案

PathScan®夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)抗体配对方案

A.     所需试剂:

  1. 包被(缓冲)液:1X PBS,(20X PBS #9808

3.2 mM Na2HPO4,0.5 mM KH2PO4,1.3 mM KCl,135 mM NaCl,pH 7.4

  1. 漂洗(缓冲)液:1X PBS / 0.05% Tween-20,(20X PBST #9809
  2. 封闭(缓冲)液:1X PBS / 0.05% Tween-20,1% BSA
  3. 1 X细胞裂解液:10X Cell Lysis Buffer #9803
    短时间内这种溶液可以放在4°C(1- 2个星期)
    注意:CST建议在使用前添加1mM苯甲磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)
    • 20 mM Tris (pH 7.5)
    • 150 mM NaCl
    • 1 mM ethylene diamine tetraacetate (EDTA)
    • 1 mM ethylene glycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)
    • 1% Triton X-100
    • 2.5 mM sodium pyrophosphate  
    • 1 mM β-glycerophosphate 
    • 1 mM Na3VO4
    • 1μg/ml leupeptin
  4. TMB 底物:(TMB Substrate #7004)
  5. 反应终止液:(STOP Solution #7002)

注意:这些试剂需现配现用。

B.      包被流程:

  1. 用水漂洗微孔板。每孔加200 µl水然后倒掉。反扣在纸巾上务必将液体吸干。
  2. 将捕获抗体按1:100用PBS稀释。为一块96孔板准备10 ml稀释抗体:在9.9 ml PBS中加入100 µl捕获抗体原液。混匀后,每个孔加100 µl。封好后4°C孵育过夜(17-20小时)。
  3. 在包被过夜后,轻轻撕去封膜,清洗各孔:
    1. 将板中的溶液倒入废液缸中。
    2. 用漂洗液洗4次,每次每孔200µl。每次清洗时,将微孔板用力扣在干净纸巾上,弃净所有液体,但注意不要让微孔板完全干掉。
    3. 用无尘纸擦拭所有孔的外底面
  4. 封闭微孔板。每个孔中加入150 µl封闭液,盖好板后37°C孵育2小时。
  5. 封闭后,按步骤3洗板。洗好后微孔板就可以用了。

C.     制备细胞裂解物

  1. 吸去培养基。换上添加有调节因子的新鲜培养基,处理所需时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞,去除培养基并用冰冷的PBS漂洗一遍。
  3. 除去PBS,每个10 cm盘中加入0.5 ml冰冷的含1 mM PMSF的1X细胞裂解液,冰上放置5分钟。
  4. 将所有细胞刮下,转移至合适的离心管中。继续放在冰上。
  5. 在冰上对样品进行超声处理。
  6. 4°C离心10分钟,将上清转移到一个新管中。上清即为细胞裂解物。分装成足够一次使用的若干份保存在–80°C。

D.     测试流程:

  1. 未稀释或在封闭液中稀释的细胞裂解物都可以用于实验。每孔加入100 µl细胞裂解物。盖上板并在37°C孵育2小时。
  2. 洗板如涂覆操作第3步。
  3. 将检测抗体1:100稀释在封闭液中。每块96孔板准备10 ml稀释抗体,在9.9 ml PBS中加入100 µl的检测抗体原液。混匀后,每孔加入100 µl。盖好板后37°C孵育1小时。
  4. 洗板操作同包被流程第3步。
  5. HRP偶联抗小鼠或抗兔的二抗用封闭液按1:1000稀释。每块96孔板准备10 ml稀释抗体,在9.99 ml PBS中加入10 µl的二抗原液。混匀后,每孔加入100 µl。盖好板后37°C孵育半小时。
  6. 洗板操作如包被流程第3步。
  7. 每孔加入100 µl T MB底物。盖好后37°C孵育10分钟。
  8. 每孔加入100 µl STOP溶液。
  9. 在适当的微孔读板仪上测定各孔在450 nm处的吸光值。

 

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