Cell Signaling Technology

免疫组化方法(石蜡切片)

免疫组化方法(石蜡切片)

*重要提示:参考抗体说明书选用合适的抗体稀释液和抗原修复处理方法。IHC方法:抗原修复缓冲液/抗体稀释液

A.     所需溶液和试剂

  1. 二甲苯
  2. 无水乙醇(100% 和 95%,变性无水乙醇,组织学级)
  3. 去离子水(dH2O)
  4. 苏木精(可选)
  5. 漂洗(缓冲)液:
    1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST): 配制时,取100 ml 10X TBS加900 ml水稀释至1升。加入1 ml Tween-20,混匀。

10X Tris缓冲盐水(10X TBS)在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷(Trizma base, C4H11NO3)和80 g 氯化钠(NaCl)。用浓盐酸将pH调节到7.6,定容至1 L。

  1. *抗体稀释液
    1. SignalStain® 抗体稀释液 #8112
    2. TBST / 5%正常山羊血清: 5 ml 1 X TBST 中添加250 µl正常山羊血清。
    3. PBST / 5%正常山羊血清: 5 ml 1 X PBST 中添加250 µl正常山羊血清。

1 X PBS / 0.1% Tween-20 (1 X PBST): 配制时,取100 ml 10X PBS加900 ml水稀释至1 L。加入1 ml Tween-20,混匀。

10X 磷酸盐缓冲液 (10X PBS): 在800 ml水中加入80 g 氯化钠(NaCl), 2 g 氯化钾(KCl), 14.4 g 磷酸氢二钠(Na2HPO4)和2.4 g 磷酸二氢钾(KH2PO4)。调整pH到7.4,定容至1 L。

  1. *抗原修复:
    1. 柠檬酸盐:10 mM柠檬酸盐缓冲液:称取2.94g二水合柠檬酸钠(C6H5Na3O7•2H2O)溶解在800 ml水中。调整pH为6.0,定容至1 L。
    2. EDTA: 1mM EDTA: 称取0.372 g EDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 溶解在800 ml水中。调整pH为8.0,定容至1 L。
    3. TE10 mM Tris/1 mM EDTA, pH 9.0: 配制时,称取1.21 g Trizma®碱(C4H11NO3)和0.372 g EDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 溶解在950 ml蒸馏水中。调整pH到9.0,然后用蒸馏水定容至到1 L。
    4. 胃蛋白酶:1 mg/ml,溶解在pH为2.0的Tris盐酸缓冲液中。
  2. 3%过氧化氢:配制时,将10 ml 30% H2O2加入到90 ml蒸馏水中。
  3. 封闭液:TBST/5%正常山羊血清:5 ml 1X TBST中添加250 µl正常山羊血清。
  4. 检测系统:根据厂家说明书使用。已有的检测系统:

SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114

SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125

注意: 如果本产品没有使用本试剂优化过,可能需要通过滴定法来确定最佳条件。

  1. DAB试剂或合适的底物:按产品说明配制。

B.      脱蜡处理/再水化

注意:操作中任何时候都不要晾干玻片

  1. 脱蜡处理/切片的水化:

a.       用二甲苯浸洗切片3次,每次5分钟。

b.       用无水乙醇浸洗切片2次,每次10分钟。

c.       用95%乙醇浸洗切片2次,每次10分钟

  1. 在蒸馏水中漂洗2次,每次5分钟。

 

C.     *抗原修复

注意:参考抗体说明书选用合适的抗原修复缓冲液,按以下步骤操作。

  1. 柠檬酸缓冲液处理:加热浸泡在10 mM pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液中的玻片,使之维持在准沸腾的温度(95-99°C)10分钟。取出放在实验台上自然冷却30分钟。
  2. EDTA处理:加热浸泡在1 mM pH 8.0 EDTA溶液中的玻片,使之维持在准沸腾的温度(95-99°C)15分钟。不需另加冷却步骤。
  3. TE处理:加热浸泡在pH 9.0的10 mM TE/1 mM EDTA溶液中的玻片,使之维持在准沸腾的温度(95-99°C)18分钟。取出放在实验台上自然冷却30分钟。
  4. 胃蛋白酶处理:37°C消化10分钟。

 

D.     染色

注意:查询产品说明书推荐的抗体稀释比例。

  1. 切片用漂洗液洗两次,每次5分钟。
  2. 浸泡在3% H202中孵育10分钟
  3. 用蒸馏水漂洗两次,每次5分钟。
  4. 用漂洗液洗5分钟
  5. 在切片上滴加100-400 μl封闭液,室温封闭1小时。
  6. 去掉封闭液,每个切片上加100-400 µl稀释的一抗。4°C孵育过夜。
  7. 去掉抗体稀释液。用漂洗液洗3次,每次5分钟。
  8. 根据厂家说明书,用合适的检测系统检测。
  9. 用漂洗液洗3次,每次5分钟。
  10. 加入100–400 µl DAB或合适的底物,近距离检测染色进展。
  11. 一旦切片染色成功,立刻将玻片浸入水中。
  12. 如有需要,将切片泡在苏木精溶液中复染,按照产品说明进行。
  13. 切片用蒸馏水洗两次,每次5分钟。
  14. 切片脱水:
    1. 在95%乙醇中孵育两次,每次10秒。
    2. 在100%乙醇中孵育两次,每次10秒。
    3. 在二甲苯中孵育两次,每次10秒。
  15. 加上盖玻片。

 

技术服务 

 

 

 

learn new product