Cell Signaling Technology

免疫组化方法(冰冻切片)

免疫组化方法(冰冻切片)

A.     所需溶液和试剂

  1. 二甲苯
  2. 无水乙醇(100% 和 95%,变性无水乙醇,组织学级)
  3. 苏木精(可选)
  4. 固定剂:请参考产品说明书选取合适的固定剂。
    1. 10%中性福尔马林
    2. 丙酮
    3. 甲醇
    4. 3%甲醛溶液:配制时,将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。
  5. 10X Tris缓冲盐水(10X TBS):在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷(Trizma base ,C4H11NO3)和80 g 氯化钠(NaCl)。用浓盐酸将pH调节到7.6。
  6. 漂洗(缓冲)液:1 X Tris缓冲盐水(TBS)。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。
  7. 甲醇/过氧化氢:配制时,将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。
  8. 封闭液:1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。
  9. 配制时,将500 µl山羊血清和30 µl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。
  10. 检测系统:根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。
  11. DAB试剂或合适的底物:按产品说明配制。

 

B.      切片

  1. 对于保存在-80°C的样品:切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切片时样品断裂。
  2. 将样品切成大约6-8 µm厚,铺在带正电性的玻片上。
  3. 固定前,可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。(这有助于切片贴紧玻片)

 

C.     固定

注意:参考产品说明书(抗体)选择合适的固定剂

  1. 玻片上的切片风干后,选用如下合适的固定剂进行固定。
    1. 10%中性福尔马林:室温10分钟。立即进行染色操作。
    2. 冰丙酮:-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。
    3. 甲醇:-20°C 10分钟。立即进行染色操作。
    4. 3%甲醛溶液:室温15分钟。立即进行染色操作。
    5. 3% 甲醛/甲醇:先在室温下3%甲醛中固定15分钟,然后在-20°C的甲醇中固定5分钟(中间不漂洗)。立即进行染色操作。

D.     染色

  1. 切片用漂洗液洗两次,每次5分钟。
  2. 室温下,浸泡在3% H202/甲醇中孵育10分钟
  3. 用漂洗液洗两次,每次5分钟。
  4. 在切片上滴加封闭液,室温封闭1小时。
  5. 按抗体说明书的推荐比例将抗体稀释在封闭液中。
  6. 去掉切片上的封闭液,每个切片上加100-400 µl稀释的一抗。4°C孵育过夜。
  7. 去掉抗体。用漂洗液洗3次,每次5分钟。
  8. 根据厂家说明书,用合适的检测系统*检测。
  9. 用漂洗液洗3次,每次5分钟。
  10. 加入100–400 µl DAB或合适的底物,近距离检测染色进展。
  11. 一旦切片染色成功,立刻将玻片浸入水中。
  12. 如有需要,将切片泡在苏木精溶液中复染,按照产品说明进行。
  13. 切片用蒸馏水洗两次,每次5分钟。
  14. 切片脱水:
    1. 在95%乙醇中孵育两次,每次10秒。
    2. 在100%乙醇中孵育两次,每次10秒。
    3. 在二甲苯中孵育两次,每次10秒。
  15. 加上盖玻片。

*已有的检测系统:

SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114

SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125 

技术服务 

 

 

 

learn new product