Cell Signaling Technology

Western免疫印迹常见问题解答

Western免疫印迹常见问题解答
问题一:背景脏
表现为普遍的背景较高或者是经过1到30秒的曝光后出现非特异条带。

原因 解决方法
一抗没有稀释在合适的缓冲液中或是稀释比例不对 合适的封闭剂封闭后,膜在推荐浓度的抗体中4°C孵育过夜(抗体稀释在恰当浓度的封闭剂-TBS/T溶液中)。多克隆抗体和兔单抗用5% BSA稀释时,信噪比最高。鼠单抗用5%脱脂牛奶稀释时,信噪比最高。对于特定的抗体请参考各自的产品说明选用推荐的稀释液。
所用的印迹膜不适合用于化学发光法检测 选用高质量的硝酸纤维素膜或是PVDF膜。测试并选择表现出高特异结合效果并且低背景的膜。目前所测试过的尼龙膜均不适合Western印迹检测。
印迹膜封闭不够,导致一抗或是二抗的非特异结合。 用TBS/T 配制的5%牛奶室温下封闭1小时。也不要过度封闭。
二抗没有稀释在合适的缓冲液中或是稀释比例不对 有些二抗能够非特异与细胞提取物中的其他蛋白相结合。要检测二抗的质量,则可以做一次不加一抗的实验来判断是否二抗的问题。也可以将二抗稀释不同的比例,用相同的细胞提取物和一抗做实验来优化二抗的浓度。
每次都用TBS/T配的 5% 牛奶稀释二抗,与膜在室温下孵育1小时。
  用于稀释LumiGLO®试剂的水纯度不够 化学发光检测反应需要用高纯度的水来稀释LumiGLO®试剂A和B。必须使用Milli-Q超纯水或其他类似的除去了有机和无机杂质的纯水。

问题二:信号弱
表现为在1-30秒曝光后仍然检测不到目的条带

原因 解决方法
一抗与膜的孵育时间不够 磷酸化蛋白抗体是针对于特定的一个或两个磷酸化位点的,特异性很高但往往比常规的抗体能得到的信号要弱一些。用合适的缓冲液稀释,并在4°C与膜孵育过夜,对于磷酸化抗体来说很关键。
电泳后的蛋白没有全部转移到膜上 增加转膜所用的时间或电压。通过预染分子量标准品判断转膜是否完全,不建议用染料染膜来观察,因为这样会抑制化学发光反应。
膜的封闭时间过长 在牛奶中封闭时间太长会遮蔽抗原表位并会把转移到膜上的蛋白置换下来。封闭只需1小时(决不要过夜封闭)。
目的基因的表达量太少,低于检测底限。 每条泳道中上样总蛋白20 µg通常就足够了。如果目的基因的表达水平较低,则可以增加上样量。或是在做SDS-PAGE之前先做免疫沉淀。尝试其他细胞系或是高表达该蛋白的组织样品。
二抗太弱。   换用其他批次的二抗或是提高二抗的浓度。
LumiGLO®试剂没有按规定配制或是储存液试剂A和B已经相互污染。 重新配制LumiGLO®试剂。用抗生物素-HRP和生物素标记的分子量标准品作为化学发光检测反应的阳性对照。

 

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