Cell Signaling Technology

Western免疫印迹方法

Western免疫印迹方法

做Western免疫印迹时,将膜孵育在稀释的抗体中轻轻摇动并4°C过夜。抗体稀释在含5% w/v BSA或1X TBS, 0.1% Tween-20的脱脂奶粉当中。

注意:参考一抗的产品说明书选用合适的抗体稀释液和稀释比例

A.      所需溶液和试剂

注意:所有溶液用Milli-Q或相当级别的水配制。   

  1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS): (#9808) 配制1L 1X PBS时,取50ml 20X PBS用950ml RODI水稀释到1L,混匀。
  2. 1X SDS 上样缓冲液 (#7722, #7723) 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8,25°C), 2% w/v SDS, 10% 甘油, 50 mM DTT, 0.01% w/v 溴酚蓝或酚红。
  3. 转膜缓冲液:25 mM Tris 碱, 0.2 M 甘氨酸, 20% 甲醇 (pH 8.5)。
  4. 10X Tris缓冲盐水(TBS): 配制1L时,称取24.2g Tris碱,80g NaCl加入1L水中;调整pH为7.6(稀释至1X使用)。
  5. 脱脂牛奶: (#9999) (重量体积比 [w/v])
  6. 封闭液:含5% w/v脱脂奶粉,0.1% Tween-20的1X TBS。配150ml时,在135ml水中兑入15ml 10X TBS,混匀;加入7.5g脱脂奶粉,使之溶解;边搅拌边加入0.15 ml Tween-20 (100%),混匀。
  7. 洗液: 1X TBS, 0.1% Tween-20 (TBS/T)。
  8. 牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA): (#9998).
  9. 一抗稀释液:含5% w/v脱脂奶粉或BSA,0.1% Tween-20的1X TBS。配20ml时,在18ml水中兑入2ml 10X TBS,混匀;加入1gBSA或脱脂奶粉,使之溶解;边搅拌边加入20 μl Tween-20 (100%),混匀。

Phototope®-辣根过氧化物酶Western印迹检测体系:(抗兔 #7071)(抗鼠#7072)

试剂盒中包括生物素标记蛋白分子量标准品(#7727),标记有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)的二抗(抗兔 #7074)( 抗鼠 #7076),抗生物素HRP偶联抗体(#7075),LumiGLO®化学发光试剂盒(#7003)。

  1. 预染蛋白分子量标准品,宽谱(预混型): (#7720)。
  2. 印迹膜:本套方法在硝酸纤维素膜上优化过,CST推荐使用硝酸纤维素膜。PVDF也可以用本方法。

 

B.      蛋白印迹

样品制备的通用方法如下所述:

  1. 刺激细胞:加入含调节因子的新鲜培养基处理一定的时间。
  2. 吸去培养基。用PBS清洗一次,吸去。
  3. 加入1X SDS样品缓冲液裂解细胞(6孔板中每孔加100 μl ,10cm盘中每盘加500 μl)
  4. 超声处理10–15秒打断DNA同时降低样品的粘度。
  5. 取20μl样品放在95–100°C加热5分钟,然后放在冰上冷却。
  6. 离心5分钟。
  7. 取20 μl加样到SDS-PAGE胶上(10 cm x 10 cm)。注意:CST建议同时加上预染蛋白分子量标准品(#7720, 10 μl/泳道)以验证转膜成功,还有生物素标记的蛋白分子量标准品(#7727, 10 μl/泳道)用于判断目的条带分子大小。
  8. 将电泳后的蛋白电转移到硝酸纤维素膜或是PVDF膜上。

 

C.       膜封闭和抗体孵育

注意:以下所用试剂体积数为10 cm x 10 cm (100 cm2)膜的用量。使用不同大小的膜时,根据面积相应调整。

I.          膜封闭

  1. (可选)转移后,室温下硝酸纤维素膜用25ml TBS清洗两次,每次5分钟。
  2. 将膜孵育在25 ml封闭液中,室温1小时。
  3. 用15 ml TBS/T清洗3次,每次5分钟。

II.        一抗孵育

  1. 根据所用一抗,继续以下相应部分的操作。

 

未标记一抗

  1. 将抗体按说明书推荐浓度稀释在10 ml一抗稀释液中。把膜孵育在一抗稀释液中4°C过夜并轻轻摇动。
  2. 用15 ml TBS/T洗3次,每次5分钟。
  3. 按一抗来源选取合适的HRP偶联的二抗,将膜孵育于封闭剂稀释的二抗中(1:2000),同时加入HRP偶联的抗生物素二抗(#7075) (1:1000)以检测生物素偶联的蛋白质标准品。室温1小时并轻轻摇动。
  4. 用15 ml TBS/T洗3次,每次5分钟。
  5. 继续D部分的检测步骤。

HRP偶联的一抗

  1. 将抗体按说明书推荐浓度稀释在10 ml一抗稀释液中。将膜孵育在一抗稀释液中4°C过夜并轻轻摇动。
  2. 用15 ml TBS/T洗3次,每次5分钟。
  3. 用HRP偶联的抗生物素抗体(#7075)检测生物素化的蛋白分子量标准品,HRP偶联的抗生物素抗体按1:1000稀释在10ml封闭液中,室温1小时并轻轻摇动。
  4. 用15 ml TBS/T洗3次,每次5分钟。
  5. 继续D部分的检测步骤。

生物素标记的一抗

  1. 将抗体按说明书推荐浓度稀释在10 ml一抗稀释液中,4°C孵育过夜并轻轻摇动。
  2. 用15 ml TBS/T洗3次,每次5分钟。
  3. 将膜孵育在合适浓度的Streptavidin-HRP稀释液中室温孵育1小时并轻轻摇动。
  4. 用15 ml TBS/T洗3次,每次5分钟。
  5. 继续D部分的检测步骤。

        不需要另加抗生物素HRP偶联抗体(#7075)检测生物素标记蛋白分子量标准品。因为所用的二抗Streptavidin-HRP同样能够使生物素标记的分子量标准品显示出来。

D. 蛋白检测

  1. 配制10 ml LumiGLO®溶液,将0.5 ml 20X LumiGLO®,0.5 ml 20X Peroxide兑入9.0 ml Milli-Q超纯水。将膜浸入其中,室温下孵育1分钟并轻轻摇动。

注意:如果信号出现得太快,可以将LumiGLO®进一步稀释。

  1. 将膜取出并吸走多余的反应底物(但不要使它晾干),包在保鲜膜中然后压上x-光片曝光。第一张胶片的曝光时间为10秒,从胶片上条带的强弱可以判断下一张胶片合适的曝光时间。

注意:由于检测反应的动力学特征,在LumiGLO®底物孵育后刚开始的信号是最强的,在随后的2个小时中,信号会不断衰减。

 

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