Cell Signaling Technology

WB问题诊断指导

推荐: 为了找到实验中可能的问题,请从下列清单中选择高背景或低信号的常见原因。为了找到实验中可能的问题,请从下列清单中选择高背景或低信号的常见原因。


观看问题诊断视频

问题:高背景或多余的条带

表现为普遍的背景较高或者是经过短时的曝光后出现非特异条带。请注意基序抗体、翻译后修饰和剪切异构体可能会导致多重的条带。

观看视频:克服高背景的技巧

高背景

裂解液的准备

新鲜制备的样品非特异性条带和降解片段更少,因而可以得到更加干净的blot结果。一般来说,组织提取物相对于细胞系提取物含有更多的背景条带和降解片段,因为连接组织。使用新鲜的超声过的澄清的组织提取物,背景更少。检测磷酸化蛋白时,样品应在合适的包含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的缓冲液中裂解 (Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) #5870Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) #5872Protease Inhibitor Cocktail #5871). 我们推荐使用细胞裂解液 (#9803) 或RIPA裂解液 (#9806),它们包含了更强的去垢剂,用于样品准备和蛋白浓度定量。SDS上样缓冲液(#7722 or #7723)可被用于除蛋白定量之外的总体细胞裂解。Chaps细胞提取液(#9852) 用于准备细胞质组分,以及研究caspase信号通路。

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使用高质量的硝酸纤维素膜 (Nitrocellulose Sandwiches #12369)。一般推荐0.2 um孔径的;当蛋白分子量小于30 kDa时,不推荐使用孔径0.45um的。不推荐尼龙膜用作western blotting。在5%的脱脂牛奶TBST液体中室温封闭1小时。

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一抗稀释和/或孵育

在TBST中4°C过夜孵育一抗,使用推荐的稀释浓度和推荐的封闭试剂(5%的BSA或5%脱脂牛奶)。对于特定的抗体请参考各自的产品说明书,选用推荐的稀释液。

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清洗不够

在TBST中清洗的时间少于推荐的3 x 5 分钟,会导致高背景。我们推荐清洗时定时以增加准确性。这适用于一抗和二抗孵育后的清洗过程。

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二抗稀释和/或孵育

有些二抗能够非特异地与细胞提取物中的其他蛋白相结合。要检测二抗的质量,则可以做一次不加一抗的实验来判断是否二抗的问题。也可以将二抗稀释不同的比例,用相同的细胞提取物和一抗做实验来优化二抗的浓度。每次都用TBST配的 5% 牛奶稀释二抗,与膜在室温下孵育1小时。用BSA稀释二抗会产生更高的背景条带。 CST™ secondary antibodies 已经过优化,不需要滴定实验。

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检测试剂

化学发光检测反应需要用高纯度的水来稀释高浓度的试剂。必须使用除去了有机和无机杂质的纯水。我们推荐使用RODI(反向渗透去离子水)。此外,在抗体孵育时,保证膜不能干燥。

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曝光时间

长于30秒的曝光时间将会导致背景信号增加。为了避免长时间曝光,使用足够蛋白表达水平的细胞系或组织,以及使用推荐的一抗孵育条件(参见一抗稀释和/或孵育部分)是很重要的。假如可能,处理样品以诱导表达或修饰。

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问题:低信号

表现为经过短时的曝光后仍然检测不到目的条带。

观看视频:克服低信号的技巧

如何改善样品

如何优化步骤

裂解液准备

通常每条泳道中上样总蛋白20-30 µg全细胞提取物就足够了。如果目的蛋白的基础水平或蛋白修饰水平较低,则需要通过化学刺激物诱导表达或修饰。你可能想调查其它目的蛋白表达水平更高的细胞系或组织。样品应在合适的包含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的缓冲液中裂解 (Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) #5870Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) #5872Protease Cocktail #5871)。超声裂解液以保证提取到足够的染色质和膜结合蛋白。请访问CST网站上的 对照汇总表 获得建议的阳性对照和处理。

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一抗稀释和/或孵育

在TBST中4°C过夜孵育一抗,使用推荐的稀释浓度和推荐的封闭试剂(5%的BSA或5%脱脂牛奶)。使用其它的封闭试剂,如明胶,血清,无蛋白封闭试剂,酪蛋白或者混合的封闭试剂,可能会减少信号。对于特定的抗体请参考各自的产品说明书,选用推荐的稀释液。

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SDS-PAGE 胶选择

一般情况下,推荐Tris-Glycine 胶,对于高分子量的蛋白,我们推荐Tris-Acetate胶和相关缓冲液。蛋白转移时,1mm的胶比1.5mm的胶更有效。使用更厚的胶会导致高分子量蛋白不完全的转移,因此我们推荐监测转移效率,根据蛋白分子量优化转移条件。

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转移和膜

不完全的转移可通过更长时间的转移或更高的电压予以纠正。一般情况下,我们推荐转移液包含20%的甲醇,在70V电压下湿转1.5小时。对于高分子量蛋白,我们推荐减少转移液的甲醇含量至5%来提高转移效率和避免将蛋白固定在胶中,以及增加转移时间到3小时(70 V)。检测小分子蛋白时,转移过度(蛋白转过膜)是个问题。对于小分子量蛋白,需要使用0.2um孔径的膜,在70V电压下湿转1.5小时,而不是0.45um的膜或者转移过夜,以避免转移过度,丢失小蛋白的信号。

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封闭

封闭时间太长会遮蔽抗原表位,阻止抗体结合。封闭只需1小时。

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清洗

清洗时间长于推荐的3 x 5 分钟,会丢失信号。这适用于一抗和二抗孵育后的清洗过程。此外,我们推荐在TBST中进行清洗,因为我们发现在PBST中清洗会减少信号。

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二抗稀释和/或孵育

将二抗稀释不同的比例,用相同的细胞提取物和一抗做实验来优化二抗的浓度。每次都用TBST配的 5% 脱脂牛奶稀释二抗,与膜在室温下孵育1小时。HRP偶联的二抗缓冲液中不要有叠氮化钠(sodium azide),因其抑制HRP活性。 CST™ secondary antibodies 已经过优化,不需要滴定实验。

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检测试剂

用抗生物素-HRP和生物素标记的分子量标准品作为化学发光检测反应的阳性对照。

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posted June 2005

 

revised February 2013

 

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